Nanopore | 玩转酵母全长转录组

酵母以其易于基因改良且生长迅速的特点，成为学术研究和工业生产的利器。近些年，随着测序技术的发展，更是晋升为三代测序技术的团宠。2017年发表在Genome Research(IF=10.101)上的“The dynamic landscape of fission yeast meiosis alternative-splice isoforms”（请点击阅读原文下载）在学术圈广为流传，是利用 PacBio 研究可变剪接的经典案例。

今年酵母搭乘 Nanopore 再发2篇高分文章（请点击阅读原文下载），从基因组、转录组全方位体验长片段测序的利好。

Nanopore 测序到底怎么样？可以做定量吗？和 PacBio 相比如何？

这篇“Complete genomic and transcriptional landscape analysis using third-generation sequencing: a case study of Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D”告诉您！（请点击阅读原文下载）

时间:2018 年 4 月 

杂志:Nucleic Acids Research

影响因子:11.561

材料和方法

样品：酵母菌种 CEN.PK113-7D

测序方案：

◈  全基因组测序：

☻ PacBio，Sequel，~4900Mb，N50为8700bp，约408X(PRJNA398797,SRP116559)

☻ Nanopore，MinIon，~830Mb，N50 为 12500bp，约 69X(PRJNA398797, SRP116559)

☻  Illumina，HiSeq 2000，先前研究序列(SRS307298)

◈ 全长转录组测序：

☻ Nanopore，MinIon，direct RNA，葡萄糖生长条件和乙醇生长条件，各 4 个 生物 学重复(PRJNA398797, SRP116559 )

☻  Illumina，HiSeq 2000，先前研究序列(SRS307298)

主要结果

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基因组数据特征分析

相比于 PacBio，MinIon 能产出更长的序列，但是 PacBio 测到的序列数量是 MinIon 的 5.6 倍左右。大部分的序列在两个平台都能检测到，个别特有的序列可能和实验阶段的片段筛选有关。

图 1 MinIon and PacBio 数据特征统计

对于不同测序平台得到的基因组数据，采用 3 种组装方式:只用 MinIon 得到的数据进行 de nove组装得到 ONT_assembly;只用 PacBio 得到的数据进行 组装得到 PacBio_assembly;用 MinIon和 PacBio 得到的数据共同进行 de nove 组装得到 OP_assembly。然后使用 Illumina 的数据对组装结 果进行校正。三种组装方式得到的 2μm 质粒都比已知的 S288C 酵母的 2μm 质粒更长，而ONT_assembly 的组装结果最好，刚好组装出 16 条染色体，1个线粒体序列，1个质粒序列;PacBio_assembly 组装的线粒体序列是断裂开的两段;OP_assembly 组装出的 contigs 最多，多出 3个端粒 DNA 片段，2 个质粒片段，而且组装时把 VII 染色体和 XIII 染色体的端粒区域连接在了一 起。 总体来看，三种组装方式得到的基因组很相近，由于 OP_assembly 的测序深度最高，与 S288C酵母的平均比对率达到了 99.6%。

表 1 三种组装方式的数据比较

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全长转录组数据特征分析

二次生长(diauxic growth)是指微生物可以利用一种营养物质产生代谢产物，当原始营养 物质被利用完后，可以进一步利用其代谢产物生长繁殖，产生新的代谢产物。最典型的二次生长 现象就是酵母菌的二次生长，即在糖源丰富时，酵母将葡萄糖糖转化为乙醇，当葡萄糖耗尽后， 酵母可以进一步将乙醇氧化为乙酸，维持生长。

分别对葡萄糖条件和乙醇条件下生长的酵母进行全长转录组测序，葡萄糖生长条件下的酵母 共计获得~509 MB(59X)数据量，包含约 530,000 高质量 reads，其中 N50 为 1150bp;乙醇条 件下的酵母共计获得~623 MB(72X)数据，约 623000 高质量 reads，其中 N50 为 1263 bp。该 技术的比对率为 88%，错误率为 12%，其中超过 70%的转录本为全长转录本，鉴定长度最长转录 本超过 5kb。全长转录本的比例随着转录本长度增加而减小，与转录本的表达量没有明显关系。有22 个转录本是明显高表达的，比如 丰度最高的转录本之一， 的同源 基因，在两个培养条件下表达量都很高;在乙醇条件下特异高表达一些与热休克蛋白、氧化胁迫 相关的基因，其中 编码柠檬酸合酶，说明此时激活了乙醛酸途径;在葡萄糖培养条件下，与 有氧呼吸、核糖体相关的基因表达量较高，符合此条件下酵母生长更快的特征。

图 2 转录组数据特征统计

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全长转录组数据差异筛选

通过主成份分析(PCA)发现两组数据有明显的差异，PC1 的贡献率达到 90%。使用 DESeq2做差异分析并对差异基因做 GO 富集分析，结果显示葡萄糖培养条件下的上调基因富集到了与转 录、翻译过程相关的 GO term，与葡萄糖培养条件下生长更快的表型吻合。在乙醇培养条件下， 上调基因主要富集到了 TCA 循环，乙醛酸通路，线粒体电子传递方面。同时，由于营养物质消耗、 毒性代谢物积累，在乙醇条件下很多与胁迫响应，分解代谢，β氧化相关的基因表达量上调。

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转录组:MinION VS Illumina

由于 Illumina 产出的是短片段，比对上基因组的 reads 数比 MinION 要多 10 倍左右。比对上的碱基总数可以反映测序深度，统计发现 MinION 约有 0.5G 数据，测序深度 64X，Illumina 约有1G 数据，测序深度 118X。(图 3E)而在平均覆盖率的统计中发现，两种平台非常相似。(图 3F) 可见，在相似的覆盖率需求下，MinION 需要的数据量更少。

图 3 转录组差异分析

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转录组数据结构分析

MinION 的数据中，我们发现相邻的 2 个基因 PTH1 (CENPK0H0281W) 和 ERG9 (CENPK0H0282W) 转录在一个转录本中，有大量的 reads 跨越了基因间区。而 Illumina 的比对结果中， 在两个 ORFs 之间的区域，比对到的 reads 不是完全覆盖的，这种低置信度的信息很可能被忽略。

图 4 THI1 和 ERG9 比对结果可视化

总结

本文将第三代测序技术与成熟的生物信息学分析流程结合起来，成功组装出真核生物的基因组。长片段测序使高质量、完整的真核基因组序列的重新组装成为可能，这为比较基因组学奠定了坚实的基础。Nanopore 测序能够准确测定编码的 mRNA 位置，基因表达量，以及转录本的结构。我们相信，Nanopore 测序将成为未来基因组和转录组重要方式。应该注意的是，本文研究的是基因组简单的酵母，在处理高等生物(动物和植物)的基因组和转录组时，需要更高的测序深度和更长的读取。

今年8月份牛津纳米孔公司与百迈客公司达成长期合作，已引入Oxford Nanopore平台，拥 有 MinION、GridION X5 和 PromethION 三种型号全套纳米孔测序仪。

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参考文献：

[1].Kuang Z, Boeke JD, Canzar S. The dynamic landscape of fission yeast meiosis alternative-splice isoforms[J]. Genome Research, 2017, 27(1):145-156.

[2].Jenjaroenpun P, Wongsurawat T, Pereira R, et al. Complete genomic and transcriptional landscape analysis using third-generation sequencing: a case study of Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D[J]. Nucleic Acids Research, 2018, 46(7).

[3].Garalde D R, Snell E A, Jachimowicz D, et al. Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores[J]. Nature Methods, 2018, 15(3).