Pacbio微生物全长多样性大放价，仅需399！

通过一代测序技术Sanger可得到16S/ITS/18S 全长序列，但成本高通量低。二代测序技术Illumina，成本低读长短通量高，只可对少数几个可变区进行扩增，在物种注释的准确性等方面仍存在进步空间。PacBio全长扩增子测序，集合了Sanger测序的读长优势和二代测序的高通量优势，可用较低的成本获得16S全长序列，并且能够在物种分类的准确性、物种鉴定的多样性等方面更契合微生物全长扩增子研究需求。

精准注释到种水平！

种水平注释率平均60%+

三代全长扩增子测序技术

将开启微生物多样性种水平鉴定的新纪元！

一、产品类型

v细菌多样性：16S rDNA编码原核核糖体小亚基 rRNA的DNA序列。在结构上分为10个保守区和9个可变区。保守区反映生物物种间的亲缘关系，可变区反映物种间的差异。

图1：细菌16S全长

v真菌多样性：ITS是编码真核生物核糖体小亚基rRNA的DNA内转录间隔区序列。由于ITS区在核糖体RNA加工过程中被剪切掉，不发挥功能作用，在进化过程中选择压力较小，进化速率约为18S rDNA的10倍，属于中度保守的区域，利用它可研究种及种以下的分类阶元。

图2：真菌ITS全长

v 原生生物多样性：原生生物是最简单的真核生物。全部生活在水中，没有角质。可分为三大类，藻类、原生动物类、原生菌类。18S rDNA是编码真核生物核糖体小亚基rRNA（18S rRNA）的DNA序列，通过分析18S rDNA序列，可较高级别上确定样品的归属及分类。

图3：18S全长

二、物种注释率统计

我们对不同类型的样品如：土壤、粪便、肠道、水体等，随机挑选了30个项目对其进行物种注释率进行研发优化，目前采用优化数据库及注释方法的策略，将其种水平平均注释率提升到60%+。二代注释到属和种的平均比例为78%和6%，相同样品采用三代进行注释时，属和种水平平均注释率为95%和60%，注释结果显著提升。

图1：实测项目物种注释率统计图2：不同环境样本中随机抽取物种注释率统计

三、测序数据量饱和度

三代微生物多样性是基于PacBio测序平台，利用单分子实时测序（SMRT Cell）的方法对marker基因进行测序。PacBio的CCS模式minPasses≥5，自我矫正，超高准确性。通过对校正后的CCS（Circular Consensus Sequencing）进行OTUs（Operational Taxonomic Units）聚类，并进行物种注释及丰度分析。可以揭示环境样品中物种构成，进一步进行Alpha Diversity、Beta Diversity和组间显著物种差异分析等，可以挖掘样品之间种类和丰度的差异。

统计数据结果显示：单样本5000条CCS即可达到饱和。

图1：测试样本稀释性曲线

四、经典案例解析

案例一：水体16S全长多样性

2019年7月，德国的莱布尼茨动物园和野生动物研究所在Scientific Reports上发表运用16S全长的方法研究污水厂流入与流出水体的菌群特性的文章。

废水处理对城市环境中的环境卫生至关重要。然而，废水处理厂（WWTP）收集化学物质，有机物和微生物，包括来自各种来源的病原体和多重抗性细菌，这些细菌可能通过污水处理厂的污水释放到环境中。为了更好地了解污水处理厂的微生物动态，我们使用全长16S rRNA基因序列对德国柏林污水处理厂2月、4月、7月和10月的污水厂流入与流出水体的细菌群落进行了研究和比较。通过污水处理厂处理过程，疾病相关细菌群体的相对丰度从有效性降低，只有军团菌和钩端螺旋体从流入物到流出物的相对比例增加。这表明污水处理厂虽然对肠道细菌有效，但可以富集并释放其他潜在致病菌进入环境中。

图1：流入及流出水体的相对丰度

案例二：鼻窦16S全长多样性

2018年美国的德雷塞尔大学医学院微生物学和免疫学系在Microbiome上发表了一篇文章。

实验使用PacBio全长16S rRNA基因进行健康鼻窦微生物的物种水平的细菌群落分析。对具有20种细菌物种的模拟群体的分析证明了在分类学分类方面100％的特异性和敏感性，对250多个物种模拟群落的检验呈现出90％以上的物种水平分类，对12名接受经蝶窦垂体切除术的受试者的6个不同鼻窦部位微生物多样性分析得知不同受试者之间的差异大于不同鼻窦部位的差异，痤疮丙酸杆菌是最主要物种。通过使用整个16S rRNA基因的CCS来克服基于标准标记基因的微生物组分析的缺陷。这种对其他标记基因的扩展可以帮助改进微生物物种的分类学并改进参考数据库，及加强微生物群落和环境之间关联的特异性。

 鼻腔的矢状面和冠状面的示意图

各测序区域注释比较

案例三：硅藻18S全长多样性

案例三：硅藻18S全长多样性

2017年美国的北卡罗来纳大学通过对从西南极半岛分离出的9种硅藻通过形态学表征性状及18S测序鉴定硅藻种类。

研究表明铁氧还蛋白，favodoxin，铁蛋白，视紫红质，质体蓝素，替代线粒体氧化酶，细胞色素c6和ISIP基因存在于大多数（但不是全部）硅藻分支中。最终，通过研究基因库及生理属性，我们可以开始发现影响硅藻分布和丰度的其他细胞机制。

采样点及系统进化分析 

案例四：土壤ITS全长多样性

2019年，高通量测序技术的发展极大地有益于我们对微生物生态学的理解，但产生短读取的方法受到物种水平分辨率和不确定性的影响。在这里，我们优化基于太平洋生物科学的元条码编码协议，涵盖内部转录间隔区（ITS区域）和rRNA基因的部分小亚基，用于物种水平鉴定所有真核生物的阳离子，特别关注真菌（包括Glomeromycota）和Stramenopila（特别是Oomycota）。

基于对爱沙尼亚复合土壤样品和模拟群落的测试，我们提出了最适合的简并引物，ITS9munngs + ITS4ngsUni用于真核生物及其中的选定组，并讨论了基于长读取的真核生物鉴定的利弊。

 物种分布柱状图

 所有测试引物列表

五、近年来全长多样性文章案例列表

参考文献：

[1] Daniela N, Lars G, et al. Characterization of bacterial communities in wastewater with enhanced taxonomic resolution by full-length 16S rRNA sequencing[J]. Scientific Reports, (2019) 9:9673.

[2] Earl J P, Adappa N D, Krol J, et al. Species-level bacterial community profiling of the healthy sinonasal microbiome using Pacific Biosciences sequencing of full-length 16S rRNA genes[J]. Microbiome, 2018, 6(1).

[3] Moreno C M, Lin Y, Davies S , et al. Examination of gene repertoires and physiological responses to iron and light limitation in Southern Ocean diatoms[J]. Polar Biology, 2017.

[4] Leho T, Sten A. Towards PacBio-based pan-eukaryote metabarcoding using full-length ITS sequences[J]. Environmental Microbiology Reports, 2019.