【科研方法12】激光扫描共聚焦显微镜技术使用指南

01 工具介绍

激光扫描共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope，CLSM）是激光、电子摄像和计算机图像处理等现代高科技手段渗透，并与传统的光学显微镜结合产生的先进的细胞分子生物学分析仪器，已经成为生物医学实验研究的必备工具。

首先介绍一下常见的分辨率：

• 人眼分辨率：0.2mm

• 普通的光学显微镜分辨率：0.25μm

• 共焦显微镜分辨率：0.18μm

02 激光共聚焦原理

Confocal 利用放置在光源后的照明针孔，和放置在检测器前的探测针孔，实现点照明和点探测。来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔上，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即共焦点，被探测点所在的平面即共焦平面。

计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像 。

与传统光学显微镜的区别

传统荧光显微镜有一个难以克服的缺点：焦平面以外的荧光结构模糊、发虚。原因是大多数生物学标本是重叠结构，假若荧光标记的结构在不同层次上都有分布，且重叠，来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜所接收，荧光显微镜的分辨率就要大大降低 。

在传统光学显微镜基础上，激光扫描共聚焦显微镜用激光作为光源，采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图像处理观察、分析和输出。 可以对样品进行断层扫描和成像，进行无损伤观察和分析细胞的三维空间结构。 同时，利用免疫荧光标记和离子荧光标记探针，该技术不仅可观察固定的细胞、组织切片,还可以对活细胞的结构、分子、离子及生命活动进行实时动态观察和检测，在亚细胞水平上观察诸如 Ca2+，pH 值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。

总结，

01. 共焦显微镜与传统显微镜的区别

1. 抑制图像的模糊，获得清晰的图像

2. 具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片

3. 增加侧向分辨率

4. 由于点对点扫描去除了杂散光的影响

激光扫描共聚焦显微镜技术的功能和应用

02. 功能

1.多荧光标记样品的高清晰度、高分辨率图像采集

2.无损伤、连续光学切片，显微“CT”

4.定量分析

5.图像处理

6.感兴趣区域扫描

03. 应用

定位、定量

动态测量

活细胞或组织内游离Ca2+分布和浓度的变化

测量    (Mg2+ 、Zn+ 、Na+ 、K+)

自由基的检测

药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量

01 应用实例

一、定位、定量

免疫荧光标记（单标、双标或三标）的定位、定量：

如：细胞膜受体或抗原的分布，微丝、微管的分布、 两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与细胞器共定位、核转录因子转位和干细胞的增值、分化

染色体基因定位

1) 细胞表面抗原、胞内某种蛋白

    免疫荧光标记： 与抗体耦联

    直标: 一抗+荧光探针，一抗和细胞表面蛋白或者细胞内的蛋白结合

    间标: 二抗+荧光探针，带有荧光的二抗和一抗结合

检测某种蛋白的表达变化（JAM3 maintains leukemia-initiating cell self-renewal through LRP5/AKT/β-catenin/CCND1 signaling）

免疫荧光，蛋白共定位

2) 细胞膜表面受体

    配体+荧光探针，如细胞表面有某种受体，则用其配体和荧光标记然后与其进行杂交，就可看到配体在细胞表面的分布

   如: nAchR、mAchR、多巴胺受体(D1,D2)

      标记 Gm1: 霍乱毒素受体        

               霍乱毒素+FITC

二、标记细胞器荧光探针

1) 线粒体 Mitochondria

Rodamin 123：505/534，可染活细胞，阳离子, 可检测线粒体膜电位,  且在多数细胞中停留时间短

JC1：线粒体膜电位低时为单体 490/527  发绿光

         线粒体膜电位高时为多聚体 490/590  发红光

可标记活细胞线粒体，且为检测线粒体膜电位最佳探针

Mitotracker Green FM 490/516：染活细胞或固定细胞，稳定不漏出

Mitotracker Orange CMTMRos 551/576： 氧化型

Mitotracker Orange：还原型,  只能染活细胞

2) 溶酶体 Lysosome

中性红 541/640: 微偏碱性,  可标记溶酶体等酸性器官为非特异性

3) 内质网 Endoplasmic

（from thermofish）

常用染料为：

Reticulum DiOC6 484/500: 非特异性, 较高浓度标记内质网,较低浓度标记线粒体              

4) 高尔基体 

Golgi apparatus NBD C6-ceramie 466/536： 可染活或死细胞

5) 细胞核

三、动态测量

Physiology: 细胞内离子动态变化测量

1) 游离Ca2+测量

检测游离Ca2+变化荧光探针的原理：

这类探针多为Ca2+螯合剂，不与Ca2+结合时不发荧光，通常也不能进入细胞膜，只有与乙酰甲酯AM相连方可进入细胞内，被细胞内酯酶水解后并与胞内游离钙结合后发出荧光。Kd值为Ca2+解离常数，表明检测Ca2+浓度的范围:0.1xKd-10xkd,  Kd和很多因素有关，如pH、 Mg2+、与蛋白的结合、温度等。

细胞内生理Ca2+浓度值(10-100n M)，细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右）

2）细胞自噬检测：

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