【科研方法35】如何轻松获得生物电镜高逼格照片？
还在为苦等生物透射电镜的结果烦恼么？
还在为看不懂生物透射电镜的结果发愁么？
还在为尝试制备生物透射电镜的样本受虐么？
小编接下来将为你介绍科学指南针重磅推出的生物外包实验服务-透射电镜介绍以及案列展示，解决你的燃眉之急。
什么是透射生物电镜？
透射电镜，即透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，简称 TEM），是一种最高分辨率可达到0.1-0.2纳米的显微镜，是观察和研究超微结构的重要工具。在生物科学研究方面，透射电镜可用来观察细胞整体结构、细胞亚细胞结构，包括（植物）细胞壁、细胞膜、细胞核和各种细胞器的变化、外源物质（如病原微生物、各种纳米颗粒）与细胞的关系，如外源物质进入细胞内部的方式、在细胞内的分布情况、细胞对外界刺激的反应（包括自噬、凋亡、坏死等）。
1. 病毒、细菌、蛋白、外泌体、脂质类样本的染色观察
当病毒、细菌、蛋白、外泌体、脂质类样本的研究目的在于观察颗粒的大小、外观形状时，可以用负染色这种简便的方法对样品进行染色，然后在透射电镜中观察。
操作步骤：纯化后的病毒以及其它颗粒、固体培养的细菌用去离子水配成悬液，滴在铜网上，经磷钨酸或醋酸双氧铀染色5-10s，在透射电镜（Hitachi H-7650）中观察。
此方法建议在就近的实验室完成，以保持样品的状态。
2. 细胞组织类样本前处理（正染色）
经过离心收集的细胞或者切割取样的动植物组织，用2.5%的戊二醛溶液4℃固定过夜。
然后按下列步骤处理样品：倒掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；用1%的锇酸溶液固定样品1-2h；小心取出锇酸废液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；用梯度浓度（包括30%，50%，70%，80%，90%和95%五种浓度）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15min，再用100%的乙醇处理20min；最后过度到纯丙酮处理20min。
用包埋剂与丙酮的混合液（V/V=1/1）处理样品1h；用包埋剂与丙酮的混合液（V/V=3/1）处理样品3h；纯包埋剂处理样品过夜；将经过渗透处理的样品包埋起来，70℃加热过夜，即得到包埋好的样品。样品在LEICA EM UC7型超薄切片机中切片，获得70-90nm的切片，切片经柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色5-10min，即可在透射电镜（HitachiH-7650）中观察。
从左至右，依次是纳米材料进入细胞局部、放大切片图和材料附着于细胞表面的切片图。
从左至右，依次展示肾小球、细胞吞噬外源纳米药物形成自噬小泡、植物根细胞。
什么是生物扫描电镜？
扫描电镜,即扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope,简称SEM），是用于检验和分析固体微观结构特征的最有用的仪器之一，主要特点是扫描电镜的图像反映了样品三维的形貌特征，可广泛用它来观察和检测生物样品、非均相有机材料、无机材料等微米、纳米范围内的表面特征。
1. 动植物组织细胞、真菌、细胞等样本的制备观察
制备步骤：将搜集到的绿豆体积大小的细胞样本或者切取5mmX5mm带培养基的微生物块或者大小约5mmX5mm，厚度1mm左右的新鲜植物组织，浸泡在2.5%的戊二醛溶液中（如样品漂浮在液面，需抽真空以去除样品中的空气），置于4℃冰箱内固定4小时以上。
离心去掉固定液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次间隔15min；用1%的锇酸溶液固定样品1.5h；小心取出锇酸废液，用0.1M，pH7.0的磷酸缓冲液漂洗样品三次，每次15min；再用不同浓度（30%，50%，70%，80%，90%和95%）乙醇对样品进行梯度脱水处理，每种浓度处理15min，再用100%的乙醇处理两次，每次20 min（每次换液前均需离心）。
样品置于临界点干燥仪中干燥，均匀粘涂在碳导电胶带上，在喷金仪中镀膜30秒后，将样品台放入扫描电镜中观察。
从左到右是真菌的菌丝和分生孢子图和材料表面大肠杆菌的附着图。
从左到右依次是真菌、小球藻以及植物叶片表面细胞展示图
从左到右依次是植物叶片气孔、鱼直肠绒毛扫描电镜图和鱼直肠微绒毛扫描电镜图
2. 薄片类样本的制备观察（液氮脆断）
制备步骤：需观察较薄且软，但又具有一定韧度样本的断面，可取宽3毫米，长8毫米左右的长方形，两边切一小口以利脆断，浸泡在液氮内待样品充分冷却（约3-5分钟）后，用样品镊子将样品掰断（小心液氮冻伤），断口朝上粘在碳导电胶带上，在喷金仪中镀膜50秒，将样品台放入扫描电镜中观察。
植物叶片脆断扫描电镜图
生物电镜送样注意事项：
1.实验材料的固定
生物材料的固定决定了整个实验的成败，非常重要！！！根据实验目的，选择新鲜样本，放置于1.5ml或2ml EP管中，迅速用固定液（2.5%戊二醛，配方如下所示）充分固定：对于细胞类，请反复收集细胞于管底直到肉眼可见绿豆大小，倒掉上清液加入1.5ml 2.5%戊二醛溶液并充分混匀。植物标本切成1x3x1mm3大小，放进戊二醛中固定，此时往往都需要抽真空，以便抽去细胞间的空气，让标本沉下来。
植物根的样品取样需要引起足够重视！！！根的不同部位差异很大，一定要取相近的部位才能进行比较。通常会选择靠近根尖的部位作为观察对象，这样细胞内含物比较丰富，而且比较容易获得一致的部位。
动物标本特别需要快速操作：动物被处死以后，应该以最快的速度取样（此时大小可能不标准），并投入到戊二醛固定液中。待空闲时候，可以取出组织块，切取表面的部分，并切成1x3x1mm^3大小，然后放进新鲜固定液中。固定好的标本放置在4℃冰箱中保存，直至寄出。
2.固定液以及缓冲液的配方：
A.配制2.5%的戊二醛水溶液：
25%戊二醛水溶液 10ml
0.2M磷酸盐缓冲液（pH7.0） 50ml
蒸馏水加至 100ml
B.配制0.2M，pH7.0磷酸缓冲液：
A液：Na2HPO4·H2O 31.61g，或者Na2HPO4·7H2O 53.63g，或者Na2HPO4·12H2O 71.64g，加蒸馏水至1000ml
B液：NaH2PO4·H2O 27.6g，或者NaH2PO4·2H2O 31.21g，加蒸馏水至1000ml
0.2M，pH7.0磷酸缓冲液：A液61ml，B液39ml。合起来是100ml
3.实验材料的保存
准备做电镜的标本，所有的环节都不能结冰！！！结冰后的材料再回到室温，细胞就会崩解，内含物流失严重，失去了做电镜的意义！！！样品取到以后，应快速固定起来，特别是动物标本，刻不容缓！植物材料如果是到野外取样，而且计划要做电镜的，可以携带配制好的戊二醛溶液。如果没有这样的条件，那要注意给植物材料保湿：将材料放进塑料袋，里面放一点水，让切口与水接触。整棵的植物就在根部保湿。一旦回到实验室，尽快取样固定，保湿毕竟会对标本造成一定改变。
4.实验材料的邮寄
标本邮寄之前，检查一下，尽量让每个EP管都装满固定液，从而确保在邮寄过程中，标本块不会跑到液体外面去了。然后，用封口膜包扎EP管，防止液体外漏。戊二醛充分固定的样本通常可以常温运输，但夏季高温时段，应放置2个冰袋，此时又要注意一定不要让标本结冰了。
出于对实验风险的考虑，尽可能每次提供同一标本的两个备份，以备万一。申请测试时，请在申请单上清楚标注标本具体内容和所有标本的编号。对于不确定样本如何制备或者测试时，请咨询科学指南针工作人员。
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