近日，小编有幸邀请到了陆军军医大学附属新桥医院王关嵩主任，为我们带来肺癌高通量测序领域的相关知识。
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问：近期J Thorac Oncol发文对比DNA-NGS与RNA-NGS检测融合基因的临床意义，请您从专业角度给我们介绍一下。
答：这是一个很有意义的研究，纳入了3787例NSCLC，传统ARMS-PCR方法在71.8%的肺腺癌病例中检测出驱动基因变异；ARMS-PCR检测为阴性的330例病例进行DNA-NGS检测，57.6%的样本中检测出驱动基因变异；DNA-NGS检测为阴性的进行RNA-NGS检测，10%的样本中检测到了基因融合/重排，METexon 14 Skipping等驱动变异。
对于经典型融合，DNA-NGS检测到的ALK和 RET融合亚型能与RNA-NGS结果一致；但64.3%( 9/14)的ROS1 DNA-NGS结果与RNA-NGS结果存在差异(融合伙伴一致，但拼接的外显子发生偏移)，可能与可变剪接相关。对于非经典融合及基型/相互融合，DNA-NGS检测到的非经典融合及基型/相互型融合中有12.8%(6/47)在RNA-NGS/IHC检测结果为阴性，强烈支持DNA检测到的融合事件最终并没有产生融合转录本/融合蛋白，RNA-NGS检测为阴性（IHC证实也是阴性）的患者在接受匹配的靶向治疗后，疗效评估均为疾病进展(PD)，PFS只有1-3个月，说明了这部分DNA-NGS结果的不可靠性。问：刚刚您介绍这项研究先是PCR，之后是DNA-NGS，然后再用RNA-NGS，真实临床也需要这么长的周期吗？
答：NGS是15年才开始进入国内的，而且国内区域发展差异大，整体上只有PCR和DNA-NGS两步，文章也是认识到这种方式的局限性。目前国外的临床实践策略主要有：“并行检测”和“序贯检测”这两种模式。
如：哈佛医学院麻省总医院(MGH)采用DNA-NGS和RNA-NGS同时进行的“并行检测”模式；纪念斯隆凯特琳癌症中心(MSKCC)则采用先行 DNA-NGS检测，当检测结果为肿瘤驱动基因泛阴性或非经典型融合和基型/相互型融合时，再行RNA-NGS检测进行有益补充的“序贯检测”模式。但在实际操作层面上仍旧存在诸多困难：“DNA-NGS”序贯“RNA-NGS” 的模式，不仅耗时，耽误及时治疗，还有可能由于前一次检测的样本消耗导致后一次检测的样本不足，而无法进行“RNA-NGS”；DNA-NGS和RNA-NGS“并行检测”模式，不仅增加了检测费用，同样也存在耗费样本量较大的问题。故仍旧需要一种更加理想的临床实践解决方案。问：听您介绍，DNA-NGS存在融合检测假阴性和假阳性问题，根本原因是什么呢？答：首先，DNA层面发生的变化需要传递给mRNA，才能合成对应的蛋白表现出功能，所以检测mRNA是一个更准确的指标。其次，重排/融合断点往往发生在非常冗长和复杂的内含子区域，不利于检测分析。第三，一些剪切点变异也会导致转录异常。这些因素综合造成了容易漏检融合变异及检测到的融合信息与转录组上真实的融合情况不一致的问题，进而影响靶向治疗的评估和决策。RNA-NGS的检测融合/重排和易位的优势显著得多。大量研究论述了，单纯的仅使用DNA模板或RNA模板尚不能完整发挥NGS的这一高通量测序技术的全方位优势。问：20年年初Clin Chem上发表了一篇PANO-Seq一管双检的方法，能否谈下您的看法？答：近来行业内已认识到对DNA和RNA均进行检测的重要性，以临床应用为出发点，以FDA和NCCN等机构推荐的靶点屈指可数，这是临床与科研的一大差异，原先数百基因对科研非常有用，然而具体到患者直接用途是有限的。另外一个是操作习惯的问题，以临床为出发点，则操作越便捷越好。一管双检流程简单，没有分叉或合并，一个批次所有样本的操作完全一致，不容易混淆。一管双检方法的设计重点是应用端的使用体验，相比于PCR+DNA-NGS+RNA-NGS序贯检测的周期，费用，样本用量都大大压缩。临床上拿到一个肿瘤样本，刚开始并不知道它有什么类型的变异，这时候选择一个合适的NGS检测方法就显得尤为重要。我们想做的，就是在不预先猜测该样本会有什么类型变异的情况下，仅使用一个单线流程就把它检测出来。