（文章篇）S3E14:circRNA的miRNA海绵作用机制
在分享今天的文献之前，先做一个扩展阅读：
“circRNA是如何形成的？”
之前认为circRNA是错误剪切而成。2013年，Jeck WR在《RNA》发文提出circRNA发生的两种模型：套索驱动环化；内含子配对驱动环化。
外显子跳跃导致套索限制性结构促进环化。而反向剪接则通过上游剪接体受体跟下游剪接体供体配对，也可导致RNA环化。另外外显子互补序列能促进其环化，并受到特异性蛋白因子调节。并且circRNA会参与很多生物学进程。所以circRNA不是简单的错误剪接。
扩展阅读，全文链接：http://pan.baidu.com/s/1dFfmu5b 密码：ttuk
今天主题是来自于上医大最新发表的一篇circRNA文章。
Qiupeng Zheng,Chunyang Bao, Weijie Guo, Shuyi Li, Jie Chen, Bing Chen, Yanting Luo,Dongbin Lyu, Yan Li, Guohai Shi, Linhui Liang, Jianren Gu, Xianghuo He & Shenglin Huang
Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs.NATURE COMMUNICATIONS.6 Apr 2016.
这篇文章主要分为几个部分：
1、正常组织与癌组织中circRNAs差异
2、发现并验证circHIPK3
3、circHIPK3的生成
4、circHIPK3功能试验
我们主要分析二、三、四部分
第一部分内容，这一部分作者做了大量的工作。主要从circRNA形成，筛选正常组织与癌组织中的circRNAs。基于找到目标分子出发。
第二部分：
作者发现了其筛选的circRNAs中有一个是由HIPK3基因的二号外显子衍生出的，取名circHIPK3。并且含有多个亚型。第三部分有详细验证。
circHIPK3、线性的HIPK3信使RNA在组织中的表达差异
用RNase R消化，确认了circHIPK3是环状RNA。
定位：circHIPK3定位胞浆。类似于lncRNA研究套路（后台回复：9，查看）。
所以，鉴于目标RNA的丰度及稳定性，确定了circHIPK3是在胞浆中高表达并稳定存在的环状RNA。
第三部分：
作者分析了HIPK3二号外显子的侧翼序列，发现有高度互补的Alu重复序列（Alu序列跟基因调控有关），在HIPK3二号外显子上游内含子中有28个短分散重复序列（SINEs），而在三号外显子下游有51个 (SINE，它是非长末端重复序列反转录转座子的一类，它们在高拷贝数中可见)。作者通过构建不同区域序列的质粒进行表达（用CRISPR/Cas9剪切掉特定序列），发现circHIPK3的表达是由HIPK3二号外显子生成，并且还需要侧翼的内含子协助。
第四部分：
沉默掉circHIPK3能抑制细胞增殖
前期报道，circRNA有很多miRNA的结合位点，能作为miRNA海绵，抑制其作用。也可参看前期“（文章篇）一石双鸟：一个环状RNA circ-Foxo3，两篇paper（上）（下），回复数字：32，33查看”。
AGO2蛋白可以在转录后调控miRNA丰度，内源性AGO2的减少会降低成熟miRNA的表达和活性。而内源性的circHIPK3能将AGO2拉下来。
由于circHIPK3相关的miRNAs能介导激活脱腺苷化，并随之使得核酸外切酶降解，从而抑制荧光素酶活性。沉默了circHIPK3能降低荧光素酶活性，过表达circHIPK3则能增强荧光素酶活性。并且后期的突变实验也表明，circHIPK3是作为miRNAs海绵。
在上述实验中，作者发现9个具有明显降低荧光素酶活性的miRNA，其中每个miRNA至少有一个circHIPK3结合位点。而这9个miRNAs都曾作为生长抑制miRNA在不同细胞环境中被报道过。实验组miR-124最能抑制细胞增殖，并且生物素偶联方法，发现miR-124能富集更多的circHIPK3。
共定位实验表明，circHIPK3与miR-124相互结合。异位表达的circHIPK3能缓解miR-124抑制增殖的作用。
所以，circHIPK3是通过miRNA海绵作用，结合miRNAs来调控细胞生长的。
全文链接：http://pan.baidu.com/s/1nuOGXoH 密码：9cnc
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