（文章篇）S4E27：拜读Naure，学外泌体研究思维
大家好，今天我们分享这篇关于外泌体相关的Nature文章：Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer.Nature. 2015 Jul 9;523(7559):177-82. doi: 10.1038/nature14581. Epub 2015 Jun 24.
1. 细胞与动物：外泌体的分离、鉴定，GPC1的发现以及GPC1+外泌体在细胞株和动物中检测。
首先从肿瘤细胞株出发，通过超速离心的方式分离胞外囊泡，然后通过囊泡大小、蛋白marker检测来鉴定分离到的囊泡是外泌体，下一步通过UPLC-MS对外泌体中的蛋白进行检测，并通过生物信息学的方法找到外泌体中特异存在的蛋白，并通过WB和胶体金透射电镜观察发现膜定位蛋白GPC1在肿瘤（胰腺癌和乳腺癌）特异性外泌体中高表达，并通过流失细胞仪检测GPC1+外泌体在肿瘤和非肿瘤细胞株中所占比例发现GPC1+外泌体在肿瘤细胞中比例显著高于非肿瘤细胞，进一步通过小鼠实验研究GPC1+外泌体含量与肿瘤负荷的关系，结果发现两者显著正相关（r=0.98，P=0.004）。
2. 临床：乳腺癌与胰腺癌病人GPC1+外泌体作为肿瘤诊断标志物biomarker效果评价
第一部分的研究是从细胞水平出发，发现GPC1+外泌体在肿瘤细胞中显著高于非肿瘤细胞，并且与肿瘤负荷显著正相关，第二部分就对乳腺癌和胰腺癌病人血液循环GPC1+外泌体的诊断效果进行研究了。首先分离鉴定32例乳腺癌，190例PDAC和100例正常人的外泌体，测定三组样本中外泌体大小、浓度和GPC1+外泌体含量，并分析三者的诊断效果，结果发现乳腺癌样本组有75%病人GPC1+外泌体含量显著高于正常组，不过其含量与乳腺癌三亚型不相关，而所有的190例PDAC样本中外泌体含量显著高于正常组。
由于外泌体中含有核酸，因此作者又对47例PDAC样本中KRAS的突变类型进行了检测，结果发现有31种存在5种形式的突变；荧光定量PCR检测发现KRAS突变型mRNA只在GPC1+外泌体中发现。
下面，作者尝试评价GPC1+外泌体对胰腺癌的早期诊断效果，实验包括两部分：discovery cohort（5例PCPL、26例BPD）和validation cohort（6例BPD、56例PDAC和20例正常人），并通过ROC曲线与常用指标CA19-9比较来评价GPC1+外泌体的诊断效果，结果发现GPC1+外泌体的诊断效果极其优秀（AUC几乎等于1）。
3. 临床：胰腺癌病人GPC1+外泌体作为预后标志物biomarker效果评价
下一步作者对临床样本中GPC1+外泌体与转移、手术前后肿瘤负荷的关系，并通过与CA19-9比较来评价GPC1+外泌体的对胰腺癌病人预后的指示效果，结果发现其表现显著好于CA19-9。
4. 通过动物模型评价GPC1+外泌体对胰腺上皮内瘤变的检测效果
为了进一步纵向评价GPC1+外泌体对胰腺癌的诊断效果，作者首先构建了PKT基因敲除小鼠模型，以模拟疾病进展，然后结合MRI、组织病理染色和GPC1+外泌体测定来分析GPC1+外泌体与胰腺癌进展中肿瘤负荷的关系。
文章的正文基本就到这里，不过附录数据还有很多，虽然我们文章讲的比较粗，但是文章本身非常值得我们精读和学习，甚至可以作为外泌体研究趋势的模板和范文，最后我们简单分享几点个人认为文章的亮点：
1. 临床方向的选择：胰腺癌的早期诊断这个棘手的方向；
2. GPC1+外泌体概念：在我们还处在分离外泌体并通过高通量进行分子鉴定的时候，作者已经提出了GPC1+外泌体的概念，不仅对外泌体中GPC1蛋白和KRASRNA进行了检测，又进一步以GPC1+外泌体为主题评价了其在胰腺癌诊断和预后中的作用。当然，既然可以有CD44+细胞，为何不能有GPC1+外泌体？疾病可以分子分型，细胞也可以，为什么外泌体不可以？
3. 效果太好：值得一提的是，以GPC1+外泌体为标志物的诊断效果实在太好，AUC几乎为1，而且显著好于CA199这一标志物，当然，GPC1+外泌体在更大样本下表现如何，真的非常值得期待；
4. 实验方法：文章的实验方法也有好多值得我们学习的地方，比如IG-TEM，FACS对GPC1+外泌体的检测，不同外泌体分离方法对结论的验证等等。
好了，文章下载链接：链接：http://pan.baidu.com/s/1mhMIUXM 密码：nff4，如果大家有问题，欢迎与我们交流。谢谢！
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