（策略篇）S5E07:信号通路研究策略三步骤

如何研究信号通路是大家都比较头痛的主题，今天我们就来理一理信号通路研究中的常用策略。

以信号通路为主题的研究，一般来说，按照研究深度可以分为包括：效应、通路、分子和序列四个层面，研究步骤如下：

一、 从效应出发（如细胞凋亡），通过涵盖多通路的手段进行中等通量的筛选（蛋白或者RNA水平，比如蛋白芯片或者PCR芯片等），以确定参与该效应的通路，以及该通路的激活或者抑制状态；

二、 以某一通路为单位，通过低通量实验WB、qPCR等手段，明确通路中的关键分子的变化，比如表达差异、定位异常、活性变化等；

三、以某一分子为单位，通过分子共表达相关性、分子互作手段（如IP、GST-Pull down等）、分子定位、活性、构象等检测手段，进一步明确分子作用的方式，以及结合的序列、结构域等。

第一步骤的研究是以效应为单位的分解，分解产出是通路。这里说的效应是比较大的概念，比如既可以是疾病水平，又可以是细胞水平，比如在确定肿瘤转移相关通路时，既可以通过转移、非转移样本进项筛选，又可以通过不同转移能力的细胞系进行筛选，这时基本单元是通路，而通路的状态又可以分为激活、抑制等。那么如何判断一条通路是被激活还是被抑制？答案是看通路的下游效应分子应答表现，比如被上调、被激活还是重定位等等。

第二步骤的研究是以通路为单位的分解，分解产出是分子。通路与分子类似，既可以看通路被激活、抑制的上游即原因，也可以看通路被激活、抑制的下游即结果, 不过很少说通路被上下调。即:我们看到的是一个黑箱（Black Box），我们知道效应改变下某一通路被激活或抑制，而通路涉及太多分子，信号在通路中逐级放大。我们可能检测到了一些分子在通路中异常，却不知道哪些分子是信号接收放大的起点。因此第二步骤的目的是从诸多分子中找到通路中信号接收的起点。从通路到信号接收分子的实验方法一般有：共表达关系、直接互作、共定位等。

第三步骤的研究是以分子为单位的分解，分解产出是序列。这一步骤承接第二步，在找到关键分子后，对分子进行分解到结构域和位点, 一般做到这个程度的话就已经非常偏基础了, 这也是高分文章通路研究中的不成文规定。

下面我们举个例子：lncRNA ABC-AS上调ZYX激活TGFβ通路促进肝纤维化的分子机制

• TGFβ通路是肝纤维化的重要通路；

• ZYX是TGFβ通路的关键分子；

• lncRNA ABC-AS与基因ZYX表达显著正相关；

• lncRNA ABC沉默后ZYX蛋白表达下调，mRNA无变化，说明lncRNA ABC对ZYX的调控发生在蛋白水平；

• 共定位检测发现两者共定位于胞浆；
  

• COIP发现ZYX与E3泛素连接酶UXX结合，暗示蛋白泛素化参与lncRNA ABC对ZYX的调控；

• lncRNA ABC沉默后TGFβ通路被抑制，细胞表型和TGFβ通路下游效应分子表达、活性变化，与TGFβ通路抑制剂效果一致；

• 功能回复：lncRNA ABC沉默，ZYX过表达后细胞表型和TGFβ通路下游效应分子表达、活性变化，说明lncRNA ABC通过ZYX起作用；

• 通过RIP、RNA-Pulldown发现lncRNA ABC-AS与蛋白ZYX直接结合；
  

• 分析构建ZYX、lncRNA ABC的全长和片段序列，分别构建克隆，通过RIP、RNA-Pulldown进一步验证lncRNA ABC与ZYX结合的序列、结构域；

• lncRNA ABC参与E3泛素连接酶UXX介导的ZYX的降解的方式研究

……

最后说明一下，通路的方式差异太大，今天的内容理论性比较强，而且多数是经验之谈，下次我们通过这篇文章来讲通路的研究方法：AMPK-SKP2-CARM1 signalling cascade in transcriptional regulation of autophagy.Nature. 2016 Jun 15.（下载链接：http://pan.baidu.com/s/1eRTH8fo 密码：4uhk）

That’s all. Thank you!

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