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(策略篇)S5E11: 新鲜出炉的cell:lncRNA转录调控炎症相关基因

2016-06-23 小张 小张聊科研

今天来分享一篇lincRNA调控免疫的文献。


A Long Noncoding RNA lincRNA-EPS Acts as a Transcriptional Brake to Restrain Inflammation.Cell. 2016 Jun 16;165(7):1672-85.链接:http://pan.baidu.com/s/1o8LAbVk 密码:x203


  1. 在微生物配体刺激下,巨噬细胞中lncRNA-EPS表达下调;

  2. lncRNA-EPS抑制免疫应答基因表达;

  3. lncRNA-EPS通过调控核小体重定位抑制免疫应答基因转录;

  4. lncRNA-EPS缺陷小鼠免疫炎症表型明显;


主要内容:

LincRNA-EPS是一个免疫调控lincRNA,在巨噬细胞中被精确调控,来控制免疫应答基因(IRGs)的表达。EPS缺乏小鼠在内毒素攻击后表现出炎症与致死率增加。EPS定位于IRGs调控区,控制核小体定位并抑制IRGs转录。EPS通过位于3’端的CANACA模体作用于核不均一核糖核蛋白L来介导这些作用。



1、巨噬细胞在微生物配体刺激下EPS水平受到抑制-这表明炎症状态下EPS下调的

首先,我们先了解以下的一些信息:

a、巨噬细胞属于免疫细胞,是细胞和分子免疫的重要研究对象.。

b、TLR是参与非特异性免疫的蛋白分子,属于内源性配体。

c、IRGs免疫反应基因,由免疫反应诱导转录的多种支配免疫反应的蛋白。

“在静息的细胞中,NF-kB 和IkB形成复合体,以无活性形式存在于胞浆中。当细胞受细胞外信号刺激后,IkB激酶复合体(IkB kinase, IKK)活化将IkB磷酸化,使NF-kB暴露核定位位点。游离的NF-kB迅速移位到细胞核,与特异性kB 序列结合,诱导相关基因转录。”

“TLRs能激发NF-κB信号通路改变基因的表达。”

上述内容是该部分实验的背景基础。

作者使用TLR2刺激巨噬细胞后,通过RNA测序确定了下调的lincRNA-EPS,而EPS在静息的巨噬细胞中是高表达的,那么作者认为EPS可能调控了IRG表达。并且验证EPS下调作用依赖于MyD88、Trif共同作用。

接下来,作者选择了一个IKK激酶(NF-kB抑制蛋白)抑制剂,发现LPS(TLR4)介导的抑制EPS水平能力减少了。并且IL-1α(NF-kB通路靶标蛋白)的mRNA水平与EPS表达呈负相关。

这部分实验验证非常精妙,通过IKK抑制剂处理后,免疫蛋白分子LPS对EPS抑制表达作用减低,这块说明了NF-kB激活,并参与调控,后面IL-1alpha水平降低,也证明了NF-kB通路激活。


可以看这个小图

接下来,作者使用外源性生物(能引发免疫)仙台病毒、李斯特菌处理BMDMs细胞,或使用TNFa、IFN干扰素刺激细胞,诱发免疫反应,发现EPS下调了。这说明了在巨噬细胞中EPS受到微生物以及炎症触发调控。



2、在巨噬细胞中,EPS缺失能增强IRGs表达-这部分内容跟上述内容是个对比

EPS缺失细胞使用LPS刺激后有多种基因表达发生了变化,并呈现时间增加。通过基因功能分析,发现上述多种差异表达的基因中,有多种免疫防御相关作用IRGs都过表达了。并且随着时间的推移,差异表达的免疫基因数量上升了。这些免疫基因中,表达显著提升的主要是细胞因子及趋化因子,干扰素刺激基因(ISGs)以及鸟苷酸结合蛋白(GBP)。

作者关注了5号染色体上的IRGs簇(Cxcl10, Ccl5,IL6)在EPS缺失的BMDMs细胞中是上调的。


3、根据上述内容,可推断,在巨噬细胞中,EPS作为炎症反应的负调控因子

异位表达的EPS,能显著减少由LPS诱导表达的IRGs,包括细胞因子,趋化因子,抗病毒ISGs。

功能获得与恢复实验表明,EPS能负调控IRGs。

ASC在炎症部位高表达增高,其含有一个caspase富集域。ASC参与caspase-1活化,调控细胞凋亡。

ASC是组装炎性体的关键适配蛋白,而炎性体是caspase-1激活复合体,能控制IL-1beta成熟ASC-Nlrp3-caspase1-IL-1beta

激活Nlrp3炎性小体能改变细胞表达EPS。

IL-1beta是一类细胞因子,它作为一个原蛋白由激活的巨噬细胞产生。能被caspase1水解成激活形式。它是很重要的一种炎症反应中间体,参与细胞的很多生理功能包括细胞凋亡。

尼日利亚菌素或E.coli能激活Nlrp3.作者通过实验发现

EPS缺失+LPS+nigericin/E.coli能上调IL-1beta,IL-1beta能激活炎症反应

而nigericin/E.coli能激活Nlrp3。所以上述过程可以表示成为EPS缺失的细胞通过LPS处理,激活炎性小体Nlrp3(ASC上调,ASC是组装炎性体的关键适配蛋白),随后IL-1beta表达提升,促发炎症反应。结合前两部分内容,表明EPS与炎症反应负相关。

 


4、在静息巨噬细胞中,EPS与染色质关联着的-引出调控IRG原因

首先,作者发现EPS主要定位于细胞核中。那么为了验证EPS是游离于核浆中,还是关联在染色质片段上面,作者通过化学的方法将内源性染色质-RNA复合物固定住,最后实验发现随机选择的3组片段上,都检测到了EPS。最后做了下验证,组蛋白RIP实验能拉下EPS,表明了EPS与染色质关联。


5、EPS抑制IRGs的染色质态来控制后者的表达-验证第四部分的结果

通过ChIP实验发现,缺乏EPS的细胞,RNA聚合酶II在IRGs转录启动子区水平提供,表明了EPS控制IRGs表达是通过转录水平的调控

所以作者认为有可能EPS参与表观调控IRGs来抑制后者的基础表达。

作者通过ChIP-qPCR来检测组蛋白3的4号赖氨酸三甲基化水平(H3K4me3,它是转录起始位点附近的转录激活标志物,会受到EPS的抑制)。试验发现,在EPS缺失的情况下,静息状态或LPS刺激的细胞中,H3K4me3水平都增加了。----这边说明了EPS缺失能引发转录激活

接着作者检测了聚合酶II的丝氨酸磷酸化水平(它是转录激活与开始进行的标志物),试验发现,缺乏EPS并通过LPS刺激下,细胞中IRGs转录启动子附近的聚合酶II丝氨酸磷酸化水平得到显著的提升。-----这边说明了EPS缺失能引发转录

RAP技术:将与目标RNA互补的寡核苷酸进行生物素标记,并由此捕获相关蛋白,随后可以鉴定捕获的蛋白。

作者通过RAP实验验证了EPS是结合到IRGs的基因位点上的,从而抑制IRGs的表达。

 “染色质可接近性:染色质结构的动态变化可以调节基因的表达。基因表达活跃的区域,染色体结构较为疏松,.组蛋白乙酰化通常发生在蛋白质的赖氨酸,中和赖氨酸上的正电荷,增加组蛋白与DNA的排斥力,使得DNA结构变得疏松,从而导致基因的转录活化。来阐明染色质和转录因子之间的相互作用的作用,关键是要确定染色质可接近性,一般来说,染色质越紧密,就越难以对转录因子和其他DNA和DNA结合蛋白质来发挥作用。DNA越容易接近,周围的基因就越有可能参与转录。核小体的存在(或缺乏)直接或间接地影响各种细胞与代谢过程,如重组、复制、着丝粒的形成和DNA修复。”

ATAC-seq是采用高通量测序法对易接近转座酶核染色质的化验。 

作者通过ATAC-seq技术,表明了在一般情况下,EPS促进核小体占据靶标IRG启动子区附近,影响该部分的染色质松散性(可接近性),来抑制IRG转录

 



6、发现核不均一核糖核蛋白hnRNPL与EPS结合,并调控IRGs转录

作者发现hnRNPL能作用与EPS。并且沉默掉hnRNPL能提升IRG的表达(包括mRNA、蛋白水平)。这表明了hnRNPL与EPS结合来调控IRG的表达

随后作者发现并验证了EPS与hnRNPL的结合部位。


7、反向说明存在EPS能抑制体内的炎症反应

前面都是基于细胞水平的实验,最后这一部分,作者通过建模小鼠,来验证存在EPS能抑制体内的炎症反应。

在小鼠多组织中发现,EPS能有效抑制多种炎症因子的表达。并且,EPS的表达有效抑制小鼠的致死率。


文章详细解释了作者发现的这个分子在炎症反应中调控关系。其中前几部分实验很巧妙。在第5部分内容中,作者使用了RAP、ATAC-seq技术,有想了解可以去搜索一下。



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