（策略篇）S5E11: 新鲜出炉的cell：lncRNA转录调控炎症相关基因
今天来分享一篇lincRNA调控免疫的文献。
A Long Noncoding RNA lincRNA-EPS Acts as a Transcriptional Brake to Restrain Inflammation.Cell. 2016 Jun 16;165(7):1672-85.链接：http://pan.baidu.com/s/1o8LAbVk 密码：x203
在微生物配体刺激下，巨噬细胞中lncRNA-EPS表达下调；
lncRNA-EPS抑制免疫应答基因表达；
lncRNA-EPS通过调控核小体重定位抑制免疫应答基因转录；
lncRNA-EPS缺陷小鼠免疫炎症表型明显；
主要内容：
LincRNA-EPS是一个免疫调控lincRNA，在巨噬细胞中被精确调控，来控制免疫应答基因（IRGs）的表达。EPS缺乏小鼠在内毒素攻击后表现出炎症与致死率增加。EPS定位于IRGs调控区，控制核小体定位并抑制IRGs转录。EPS通过位于3’端的CANACA模体作用于核不均一核糖核蛋白L来介导这些作用。
1、巨噬细胞在微生物配体刺激下EPS水平受到抑制-这表明炎症状态下EPS下调的
首先，我们先了解以下的一些信息：
a、巨噬细胞属于免疫细胞,是细胞和分子免疫的重要研究对象.。
b、TLR是参与非特异性免疫的蛋白分子，属于内源性配体。
c、IRGs免疫反应基因，由免疫反应诱导转录的多种支配免疫反应的蛋白。
“在静息的细胞中，NF-kB 和IkB形成复合体，以无活性形式存在于胞浆中。当细胞受细胞外信号刺激后，IkB激酶复合体（IkB kinase, IKK）活化将IkB磷酸化，使NF-kB暴露核定位位点。游离的NF-kB迅速移位到细胞核，与特异性kB 序列结合，诱导相关基因转录。”
“TLRs能激发NF-κB信号通路改变基因的表达。”
上述内容是该部分实验的背景基础。
作者使用TLR2刺激巨噬细胞后，通过RNA测序确定了下调的lincRNA-EPS，而EPS在静息的巨噬细胞中是高表达的，那么作者认为EPS可能调控了IRG表达。并且验证EPS下调作用依赖于MyD88、Trif共同作用。
接下来，作者选择了一个IKK激酶（NF-kB抑制蛋白）抑制剂，发现LPS（TLR4）介导的抑制EPS水平能力减少了。并且IL-1α（NF-kB通路靶标蛋白）的mRNA水平与EPS表达呈负相关。
这部分实验验证非常精妙，通过IKK抑制剂处理后，免疫蛋白分子LPS对EPS抑制表达作用减低，这块说明了NF-kB激活，并参与调控，后面IL-1alpha水平降低，也证明了NF-kB通路激活。
可以看这个小图
接下来，作者使用外源性生物（能引发免疫）仙台病毒、李斯特菌处理BMDMs细胞，或使用TNFa、IFN干扰素刺激细胞，诱发免疫反应，发现EPS下调了。这说明了在巨噬细胞中EPS受到微生物以及炎症触发调控。
2、在巨噬细胞中，EPS缺失能增强IRGs表达-这部分内容跟上述内容是个对比
EPS缺失细胞使用LPS刺激后有多种基因表达发生了变化，并呈现时间增加。通过基因功能分析，发现上述多种差异表达的基因中，有多种免疫防御相关作用IRGs都过表达了。并且随着时间的推移，差异表达的免疫基因数量上升了。这些免疫基因中，表达显著提升的主要是细胞因子及趋化因子，干扰素刺激基因（ISGs）以及鸟苷酸结合蛋白（GBP）。
作者关注了5号染色体上的IRGs簇（Cxcl10, Ccl5,IL6），在EPS缺失的BMDMs细胞中是上调的。
3、根据上述内容，可推断，在巨噬细胞中，EPS作为炎症反应的负调控因子
异位表达的EPS，能显著减少由LPS诱导表达的IRGs，包括细胞因子，趋化因子，抗病毒ISGs。
功能获得与恢复实验表明，EPS能负调控IRGs。
ASC在炎症部位高表达增高，其含有一个caspase富集域。ASC参与caspase-1活化，调控细胞凋亡。
ASC是组装炎性体的关键适配蛋白，而炎性体是caspase-1激活复合体，能控制IL-1beta成熟。ASC-Nlrp3-caspase1-IL-1beta
激活Nlrp3炎性小体能改变细胞表达EPS。
IL-1beta是一类细胞因子，它作为一个原蛋白由激活的巨噬细胞产生。能被caspase1水解成激活形式。它是很重要的一种炎症反应中间体，参与细胞的很多生理功能包括细胞凋亡。
尼日利亚菌素或E.coli能激活Nlrp3.作者通过实验发现
EPS缺失+LPS+nigericin/E.coli能上调IL-1beta，IL-1beta能激活炎症反应。
而nigericin/E.coli能激活Nlrp3。所以上述过程可以表示成为EPS缺失的细胞通过LPS处理，激活炎性小体Nlrp3（ASC上调，ASC是组装炎性体的关键适配蛋白），随后IL-1beta表达提升，促发炎症反应。结合前两部分内容，表明EPS与炎症反应负相关。
4、在静息巨噬细胞中，EPS与染色质关联着的-引出调控IRG原因
首先，作者发现EPS主要定位于细胞核中。那么为了验证EPS是游离于核浆中，还是关联在染色质片段上面，作者通过化学的方法将内源性染色质-RNA复合物固定住，最后实验发现随机选择的3组片段上，都检测到了EPS。最后做了下验证，组蛋白RIP实验能拉下EPS，表明了EPS与染色质关联。
5、EPS抑制IRGs的染色质态来控制后者的表达-验证第四部分的结果
通过ChIP实验发现，缺乏EPS的细胞，RNA聚合酶II在IRGs转录启动子区水平提供，表明了EPS控制IRGs表达是通过转录水平的调控。
所以作者认为有可能EPS参与表观调控IRGs来抑制后者的基础表达。
作者通过ChIP-qPCR来检测组蛋白3的4号赖氨酸三甲基化水平(H3K4me3，它是转录起始位点附近的转录激活标志物，会受到EPS的抑制)。试验发现，在EPS缺失的情况下，静息状态或LPS刺激的细胞中，H3K4me3水平都增加了。----这边说明了EPS缺失能引发转录激活
接着作者检测了聚合酶II的丝氨酸磷酸化水平（它是转录激活与开始进行的标志物），试验发现，缺乏EPS并通过LPS刺激下，细胞中IRGs转录启动子附近的聚合酶II丝氨酸磷酸化水平得到显著的提升。-----这边说明了EPS缺失能引发转录
“RAP技术：将与目标RNA互补的寡核苷酸进行生物素标记，并由此捕获相关蛋白，随后可以鉴定捕获的蛋白。”
作者通过RAP实验验证了EPS是结合到IRGs的基因位点上的，从而抑制IRGs的表达。
“染色质可接近性：染色质结构的动态变化可以调节基因的表达。基因表达活跃的区域，染色体结构较为疏松，.组蛋白乙酰化通常发生在蛋白质的赖氨酸，中和赖氨酸上的正电荷，增加组蛋白与DNA的排斥力，使得DNA结构变得疏松，从而导致基因的转录活化。来阐明染色质和转录因子之间的相互作用的作用,关键是要确定染色质可接近性，一般来说,染色质越紧密,就越难以对转录因子和其他DNA和DNA结合蛋白质来发挥作用。DNA越容易接近,周围的基因就越有可能参与转录。核小体的存在(或缺乏)直接或间接地影响各种细胞与代谢过程,如重组、复制、着丝粒的形成和DNA修复。”
“ATAC-seq是采用高通量测序法对易接近转座酶核染色质的化验。 ”
作者通过ATAC-seq技术，表明了在一般情况下，EPS促进核小体占据靶标IRG启动子区附近，影响该部分的染色质松散性（可接近性），来抑制IRG转录。
6、发现核不均一核糖核蛋白hnRNPL与EPS结合，并调控IRGs转录
作者发现hnRNPL能作用与EPS。并且沉默掉hnRNPL能提升IRG的表达（包括mRNA、蛋白水平）。这表明了hnRNPL与EPS结合来调控IRG的表达。
随后作者发现并验证了EPS与hnRNPL的结合部位。
7、反向说明存在EPS能抑制体内的炎症反应
前面都是基于细胞水平的实验，最后这一部分，作者通过建模小鼠，来验证存在EPS能抑制体内的炎症反应。
在小鼠多组织中发现，EPS能有效抑制多种炎症因子的表达。并且，EPS的表达有效抑制小鼠的致死率。
文章详细解释了作者发现的这个分子在炎症反应中调控关系。其中前几部分实验很巧妙。在第5部分内容中，作者使用了RAP、ATAC-seq技术，有想了解可以去搜索一下。