（文章篇）S5E28：同一个miRNA发5分和8分差距真的这么大么？

miR-644a作为一个较新的miRNA，从PubMed上也只搜索到了三篇相关的文献，最早报道是源于2012年Plos One。前天的一篇miR-644a很多人觉得发得比较亏，有人觉得可以发到Cancer Research上。

今天我们就来看一篇Clin Cancer Res上的miR-644a。

Downregulation of MicroRNA-644a Promotes Esophageal Squamous Cell Carcinoma Aggressiveness and Stem-cell-like Phenotype via Dysregulation of PITX2. （Clin Cancer Res，Jul 12 2016）

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PITX2是Wnt通路下游效应分子，能激活细胞增殖、生存的靶标基因的表达。

miR-644a在肿瘤组织中低表达，该miR-644a能减弱ESCC的恶性程度、抑制干细胞特性。它与PITX2呈表达负相关。通过下调miR-644a能直接上调PITX2从而激活Akt/GSK-3β/β-catenin通路，增强肿瘤细胞的侵袭性。另外启动子的超甲基化作用是ESCC下调miR-644a表达的主要原因。

看一下主要思路，太长不看版看标题：

1、首先，依然是找目标分子，找关系

作者通过miRANDA预测软件，结合NCBI/GEO/GSE23142前期报道在ESCC下调的miRNAs，取交集发现了miRNA-644a。

PITX2作为Wnt通路下游效应分子，能激活细胞增殖生存的靶标基因的表达。下面就开始验证miR-644a与PITX2作用关系。

a、miR-644a在肿瘤组织与肿瘤细胞中下调的。b、在PITX2高表达的样本或细胞中miR-644a是低表达的。确定了两者的表达呈负相关。

与临床结合，miR-644a与PITX2与预后相关。miR-644a表达越低，ESCC病人手术后越容易发生复发及远端转移。相反，高表达miR-644a病人预后较好。

2、miR-644a体外及体内的功能研究

PITX2的mRNA存在一个与miR-644a种子域互补的序列。且验证了，它们之间就是通过这个区域结合。

还是细胞实验，验证miR-644a对肿瘤细胞增殖、克隆形成、迁移、侵袭作用的影响。

实验发现，miR-644a能抑制肿瘤细胞的一些特性，如减慢细胞增殖与克隆形成，抑制细胞的侵袭与转移作用。表明了miR-644a有抑癌作用，跟前天那篇miR-644a的结论一样（并不是绝对的哦，说不定在不同的肿瘤细胞中也会存在双面间谍的作用）。

接着是动物实验验证。首先miR-644a能抑制肿瘤生成，其次H&E染色发现，对照组中肿瘤细胞呈现出分叉状生成形式，并扩散到周边组织。而过表达miR-644a的肿瘤细胞呈圆滑状，无侵润状态。

并且，小鼠转移模型发现，注射过表达miR-644a细胞的小鼠，肝脏转移肿瘤结节要少很多。

3、机制研究。

依然从细胞实验引出：共过表达miR-644a、PITX2引发抑制细胞的增殖、克隆形成、侵袭与转移作用。但这种作用没有单纯过表达miR-644a效果来得高。反向验证沉默PITX2也能引起上述作用。这部分内容验证了第一部分内容。

这里如果再加一个干扰掉过表达miR-644a细胞中PITX2，确认细胞的表型，才能更加说明问题：miR-644a通过PITX2起作用。

那么这种调控作用的关系是什么样的呢？

前期报道，PITX2关联Wnt/β-catenin通路。通过实验发现过表达miR-644a的ESCC细胞中，β-catenin及相关下游基因的表达显著下降。同时显示出β-catenin胞浆与胞核中重分配（定位胞浆。而Wnt经典通路中，β-catenin定位于胞核，促进基因表达），这里说明miR-644a调控了Wnt/β-catenin。

另外，β-catenin与下游基因Lef-1 、c-myc启动子区TCF位点结合减低（TCF参与Wnt/β-catenin通路）。

另外，作者通过TOP/FOP flash荧光实验（测定细胞内beta-catenin介导的转录活性的方法）发现报告基因的表达受到miR-644a抑制，表明miR-644a抑制β-catenin转录。

这部分内容说明，miR-644a通过抑制PITX2表达，来阻遏激活Wnt/β-catenin通路。

4、体外体内细胞干性相关实验-Wnt/β-catenin通路

激活Wnt/β-catenin通路被认为是导致细胞转变为干细胞样特征的主要原因，而且这种干细胞样特别对肿瘤的复发与转移起到作用。上述第三部分内容已经证实，miR-644a能阻遏Wnt/β-catenin通路，所以，作者猜测miR-644a是否能抑制细胞获得干细胞样特征。

过表达miR-644a后检测多种细胞干性相应的分子，发现这些分子的表达都降低了。且细胞呈更小更少的球状，并对化疗药物敏感！并且干扰PITX2也能起到相同作用。

裸鼠成瘤实验发现，过表达miR-644a小鼠体内的肿瘤生长速度大小均变慢。另外检测了肿瘤组织样本中的干性相关分子的表达，确认与miR-644a的表达呈负相关，和细胞实验一致。

5、细胞侵润，成球能力-Akt/GSK-3β/β-catenin通路

前期报道Akt激活抑制GSK-3β，随后激活Wnt/β-catenin通路。

作者通过过表达miR-644a，检测细胞中PITX2, p-Akt, p-GSK-3β (非激活态) ，active-β-catenin表达下调。并且通过rescue实验，将PITX2转染到过表达miR-644a中，能恢复上述蛋白的表达。这表明miR-644a通过PITX2来抑制Akt/GSK-3β/β-catenin通路。

并且在组织样本中也验证了miR-644a与PITX2, p-Akt, p-GSK-3β 表达呈负相关。

这边作者做一个乙酰化调控实验：已知Akt赖氨酸乙酰化调控其磷酸化和激活作用，随后调控下游效应分子。作者想了解一下miR-644a是否参与Akt， GSK-3β ， β-catenin乙酰化作用。实验发现过表达miR-644a能显著提升Akt乙酰化水平，另外过表达PITX2则能抑制这种作用。这表明在ESCC中，miR-644a抑制PITX2调控Akt乙酰化。

6、上面的研究围绕着miR-644a参与调控作用而设计的。事实上，在肿瘤组织中miR-644a是低表达的。而这种下调作用的原因，才是连接临床治疗的关键。

miR-644a是ITCH基因内含子编码，其在ESCC中的表达与ITCH的mRNA表达水平相关。通过UCSC数据库分析ITCH启动子区，其CpG岛位于转录起始位点-285 bp 至 -56 bp区。随后BGS(重亚硫酸盐基因组测序)PCR（启动子甲基化分析），发现在miR-644a低表达的ESCC细胞株与样本中，ITCH启动子区（与miR-644a共表达）超甲基化。随后，使用甲基化抑制剂处理低表达miR-644a细胞株，发现能恢复miR-644a的表达。这表明，ESCC中miR-644a低表达归咎于其启动子超甲基化。

总结一下：找分子，细胞实验（表型），动物实验（表型验证），有表型了扯通路及明星分子，找机制。

That’s all. Thank you!

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