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(文章篇)S5E58:外泌体研究案例

2016-09-08 梦熊 小张聊科研

有小伙伴表示,找不到前期我们介绍外泌体的文章,自己很想了解一下火热的外泌体研究套路。

那么我们先来看一下外泌体的背景。


1 外泌体是什么

外泌体其特指直径在40-100nm的盘状囊泡内部包裹了蛋白、mRNA和microRNA等物质。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体,经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。

 

2 外泌体的作用

外泌体的功能取决于其所来源的细胞类型,其可参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等方方面面。有研究表明肿瘤来源的外泌体参与到肿瘤细胞与基底细胞的遗传信息的交换,从而导致大量新生血管的生成,促进了肿瘤的生长与侵袭。


3 外泌体的分离

这是很多人面对的第一个大问题:

一是超速离心法,这是目前外泌体提取最常用的方法。此种方法得到的外泌体量多,但是纯度不足,电镜鉴定时发现外泌体聚集成块, 由于微泡和外泌体没有非常统一的鉴定标准,也有一些研究认为此种 方法得到的是微泡不是外泌体。

二是过滤离心, 这种操作简单、省时,不影响外泌体的生物活性,但同样存在纯度不足的问题。

三是密度梯度离心法, 用此种方法分离到的外泌体纯度高,但是前期准备工作繁杂,耗时,量少。

四是免疫磁珠法,这种方法可以保证外泌体形态的完整,特异性高、操作简单、不需要昂贵的仪器设备,但是非中性pH 和非 生理性盐浓度会影响外泌体生物活性, 不便进行下一步的实验。

五是PS亲和法,该方法将PS(磷脂酰丝氨酸)与磁珠结合,利用亲和原理捕获外泌体囊泡外的PS。该方法与免疫磁珠法相似,获得的外泌体形态完整,纯度最高。由于不使用变性剂,不影响外泌体的生物活性,外泌体可用于细胞共培养和体内注射。但该方法较新,使用成本偏高。

六是色谱法,这种方法分离到的外泌体在电镜下大小均一,但是需要特殊的设备 , 应用不广泛 。

外泌体分离后,还需要通过大小及表面marker进行鉴定。

 

 

今天我们细细看一篇外泌体研究的文章。

外泌体由于携带了蛋白、mRNA、miRNA,所以部分的研究内容也就转移到这样分子功能及机制的研究上去了。

Exosomes Derived from Hypoxic Oral Squamous Cell Carcinoma Cells Deliver miR-21 to Normoxic Cells to Elicit a Prometastatic Phenotype (Cancer research IF 8.5 March 18, 2016)

下载链接:http://pan.baidu.com/s/1c2DlzVi


实体瘤的缺氧与侵袭和不良预后相关。作者发现,缺氧口腔鳞癌细胞(OSCC)来源的外泌体,能在HIF1α和HIF2α参与下增加OSCC细胞的侵袭和迁移作用。已知外泌体能携带转运miRNA来改变细胞功能,通过实验,作者发现了一个miR-21,在缺氧环境下其表达显著上调,而在缺失miR-21的情况下,能降低外泌体中miR-21的丰度,最终能抑制细胞的迁移和侵袭作用。外泌的miR-21能显著增加Snail蛋白(EMT转化的明星蛋白)和波形蛋白的表达,降低OSCC细胞的E-钙粘素。

所以,这表明缺氧微环境能刺激细胞生成更多富含miR-21的外泌体,并且这些外泌体将miR-21转移到正常氧含量的细胞中,促进预转移行为。


主要内容:

1、外泌体的分离、鉴定与功能验证

作者通过ExoQuick外泌体抽提试剂盒沉淀分离出来。前面讲过,分离后的外泌体需要检测是真的外泌体,而非其他小囊泡。

通过扫描式电子显微镜观察,发现分离出来的囊泡大小为50-200nm,这个符合要求。其次检测外泌体marker -CD63、CD81,也检测到了。这表明分离出来的的确是外泌体。

外泌体筛选好后,接着就是检测它的功能。

伤口愈合实验(细胞划痕实验)表明,缺氧肿瘤细胞来源的外泌体能加速细胞迁移,并且这种作用跟HIF1α和HIF2α的表达相关。另外,使用缺氧OSCC细胞来源的外泌体,也能增加正常氧含量细胞的侵袭作用。



2、外泌体携带分子筛选及功能验证

众所周知,外泌体能携带miRNA及mRNA去改变细胞的功能。这里作者关注了miRNA。

通过RNA-seq,作者获得了大量RNA信息,其中miRNA量占缺氧和正常含氧细胞来源外泌体携带RNA的11%和37%,接着通过对比miRBase数据库,分别找到223、288个具有代表性的miRNA。这些miRNAs中,有214个在两组中都存在的。接下来,热图表明有108个miRNA表达具有差异(倍数变化>2),这其中有105个是在缺氧外泌体中是上调的。最终选择了三个miRNA-miR-21, miR-205,  miR-148b进行后续的验证,通过缺氧处理,这三个miRNA在细胞分泌的外泌体中表达显著上升。



3、锁定目标分子,研究它的机制

第二部分实验确定了三个分子,最终,作者选择了miR-21。

第一部分内容,发现外泌体调控细胞迁移侵袭作用与HIF1α和HIF2α(缺氧诱导因子)有关,而这里又选了miR-21做主角,那就继续在它们之间找关系。

果然,miR-21与HIF1α和HIF2α的作用关系和缺氧OSCC细胞来源的外泌体一样。在缺氧条件下,miR-21的表达依赖着HIF1α和HIF2α的表达。


有上述实验其实就暗示了,缺氧OSCC细胞来源的外泌体通过了miR-21介导了细胞的迁移和侵袭作用。

敲减miR-21能明显降低细胞的迁移和侵袭作用。



而rescue实验则能恢复细胞的侵袭迁移作用。


这里作者还提及到,miR-21的表达能促进EMT作用,提高波纹蛋白的表达。


4、体内实验(动物实验)


敲减miR-21能抑制肿瘤体积,阻遏肿瘤细胞淋巴结转移。

上面提到了miR-21与EMT相关。作者就简单做了一下EMT相关蛋白,以及miR-21的靶蛋白表达关系。敲减缺氧OSCC细胞外泌体中的miR-21能恢复E-钙粘素的表达(上皮marker),表明敲减miR-21抑制了EMT。



5、临床意义

外周血中miR-21与OSCC病人的淋巴结转移相关。 研究发现,OSCC病人血浆中外泌体中miR-21明显高于正常受试者,其表达水平与肿瘤分期及淋巴结转移密切相关。此外,外周血中分泌的miR-21也与HIF1α和HIF2α相关。



临床病理特征信息。作者把108个口腔鳞癌病人的病理参数进行分析,发现miR-21与T、N分期、HIF1α、HIF2α显著相关。

总之,外泌体研究分为以下几步:a、分离外泌体,b、鉴定外泌体,c、外泌体功能研究,d、挑选外泌体携带的分子,e、研究该分子功能,与外泌体功能一致,f、外泌体及分子水平的动物实验,g、临床相关性




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