CRISPR筛选技术帮你高效率发现目的基因

CRISPR 技术自从诞生以来，正在迅速催化生命科学研究，精准的基因组编辑功能已经成为很多实验室的常规工具。CRISPR/Cas9技术（Clustered Regularly Interspace Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated nuclease 9），和常规的基因编辑技术相比，CRISPR/Cas9技术更易操作，效率更高，细胞毒性更低，脱靶效应较少，其在癌症研究、构建动物肿瘤模型、筛选抗肿瘤或致肿瘤基因、癌症的基因治疗方面潜力巨大，其中CRISPR筛选技术更是越来越多被功能基因组学科学家所青睐。

(一) 功能基因组学中的基因编辑技术

基因组的研究能让我们对生命更加地了解，如此繁多的基因，表观遗传学的印记，调控元件以及拓补异构域在如何决定整个细胞的功能方面，知之甚少。功能基因组学（Functional genomics）运用遗传学原理，通过识别、改造某个基因在一个或多个生物模型中的作用来认识新发现基因的功能。其中基因打靶技术（knockin、knockout、deletion等）非常重要，其通过同源重组、干细胞技术对基因进行改造，使得功能基因组学取得了长足的发展。

1) RNAi技术：可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，属于转录水平的调控，作用于RNA水平，但其缺点是脱靶效应严重，阻碍了其作为大规模基因功能筛选技术。

2) ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9是三大基因编辑技术。基因编辑技术本质上均是利用非同源末端链接途径(NHEJ)修复和同源重组(HR)修复，联合特异性DNA的靶向识别及核酸内切酶完成的DNA序列改变。

这三种编辑工具的共同点是：含有靶点DNA序列的识别区域及DNA剪切功能区域，其中ZFN技术具有锌指结构域能够识别靶点DNA，而TALEN的DNA识别区域是重复可变双残基的重复，DNA剪切区域都是一种名为Fokl的核酸内切酶结构域。CRISPR的DNA识别区域是crRNA或向导RNA，Cas9蛋白负责DNA的剪切。ZFN 的基因打靶效率能够达到 30%左右，而TALE 分子的模块组装和筛选过程比较繁杂，需要大量的测序工作，对于普通实验室的可操作性较低，而商业化公司构建也需要花费上千美元，使用成本较高。CRISPR/Cas9 系统介导的基因组编辑是由crRNA 指导的，对靶序列的识别是 RNA 与 DNA 的碱基配对过程，相比蛋白质对 DNA 序列的识别要精确更多，降低了脱靶切割的几率，减低了细胞毒性。而且 CRISPR/Cas9 的构建仅仅需要设计与靶序列互补的 RNA 即可，过程相对于 TALEN 更为简单和廉价，普通的实验室也可以自行完成构建，这大大提高了基因操作的效率及简便性。

(二) 功能基因组学中大规模筛选技术的必要性

自从人类基因组完成之后，科学家的最重要的任务是对标记的基因进行研究，以了解它们在生理过程、疾病中所扮演的功能，但是高通量研究工具的缺乏再加上如此庞大的基因数，使得科学家的研究进展非常缓慢，CRISPR/Cas9 技术的出现使得科学家们有了一种全基因组层面，高通量研究基因功能的工具。

(三) CRISPR/CAS9筛选技术举例

以《Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system》（Science）为例。

①　文库准备：作者做了一个含有73,000个sgRNA的文库，覆盖了7000多个基因，每个基因平均有多个sgRNA与之对应。

②　筛选原理：基于DNA错配修复原理，MMR机制(mis-match repair，MMR)，如果细胞的DNA发生错配损伤，此MMR系统发挥作用，进行修复，保证细胞的存活，MMR系统参与的蛋白有hMSH1-6和hMLH1-5等。如果把细胞放在6-硫鸟嘌呤环境中，6-硫鸟嘌呤将会强烈抑制MMR路径，导致细胞的死亡。如果把这些蛋白敲减或失活，细胞在6-硫鸟嘌呤环境中存活，这类细胞也会得到富集。

③　文库导入细胞并培养：将sgRNA文库质粒、Cas9质粒通过慢病毒侵染KBM7 cells，使得CRISPR/Cas9发挥作用，对KBM7 cells的基因进行编辑。

④　6-硫鸟嘌呤的阳性富集：将处理后的细胞在6-硫鸟嘌呤抗性环境中进行培养，使得MMR相关蛋白缺失的细胞株被富集下来，其他的全部死掉。

⑤　结果分析：对富集下来进行细胞进行测序，发现20个sgRNA都是针对MMR相关蛋白的，这也说明了CRISPR/Cas9筛选技术的可行性。 

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