美国大牛亲自解读其最新Science文章：功能微肽
昨天小张简单介绍了“微肽”（难道研究这个真的会火？，点击查看），很有幸Eric Olson Lab课题组成员Dr.Z看到了这篇稿件。
关于Eric Olson Lab到底有多牛呢，大家可以看一下下面杂志的cover吧，都是他们课题组的（光CELL就有16篇啊！）。详情见文末Citation链接。
今天该课题组Dr.Z为大家带来最新Eric Olson Lab发表的一篇Science，以及对微肽研究的看法。
Eric Olson实验室一直致力于寻找调控骨骼肌分化发育的新基因。五年前，该实验室通过RNA-seq 和Whole Embryo Insitu Hybridization发现了一个新基因（Tmem8c），其功能没有被研究过。通过经典的ES Cell Targeting，该实验室成功地将该基因敲除。
令人感到惊讶的是当该基因被敲除后，小鼠胚胎的成肌细胞（Myoblast）无法融合成具有多细胞核的肌纤维。换句话说，小鼠胚胎只是“皮包骨”，无法生成具有功能性的肌肉。由于该基因对肌肉发育的重要性，该实验室将其命名为Myomaker。通过进一步的细胞研究，该实验室发现当Myomaker在非成肌细胞里（例如10T1/2成纤维细胞）过表达后，非成肌细胞可以和成肌细胞融合。然而，过表达Myomaker的非成肌细胞无法自身融合。这一试验表明成肌细胞可能还表达另外的膜蛋白，对细胞融合起促进作用。在随后的几年，该实验室一直尝试着寻找能够和Myomaker相互作用的膜蛋白，以期待发现对成肌细胞融合起促进作用的新基因。
随着CRISPR/Cas9技术的发展，利用CRISPR/Cas9 Library对细胞进行loss-of-function筛选变得轻而易举。该实验室利用CRISPR/Cas9 Library对成肌细胞进行了全基因组loss-of-function筛选。此次筛选总共使用了130209个gRNA，以确保每一个基因至少能够被3个独立的gRNA敲除。当对成肌细胞融合起重要作用的基因被敲除后，成肌细胞无法形成肌管（Myotube）。
形成肌管的肌细胞对培养皿的附着能力下降。通过采用不同浓度的胰蛋白酶离散细胞，形成肌管的肌细胞被选择性地离散出培养皿。通过这一巧妙的方法，附着能力强的成肌细胞被选择性地留存了下来。而这些附着能力强的成肌细胞理论上被敲除了重要的基因，以至无法融合成肌管。被敲除的基因通过进一步的测序来确定。其中，有一个被敲除的基因叫做Gm7325。该基因之前被标注为Long Noncoding RNA (LOC101929726)，但其实能够被转录和进一步翻译成84个氨基酸的微肽，于是该试验将其命名为Myomixer。该实验室首先在C2C12成肌细胞系里将该基因敲除，发现成肌细胞无法融合成肌管。接着，又通过CRISPR/Cas9技术在小鼠受精卵内将该基因敲除，发现小鼠胚胎无法生成具有功能性的肌管。先前该实验室发现当Myomaker在非成肌细胞里（例如10T1/2成纤维细胞）过表达后，非成肌细胞可以和成肌细胞融合。然而，仅仅过表达Myomaker的非成肌细胞无法自身融合。令人意想不到的是，当非成肌细胞同时过表达Myomaker和Myomixer后，竟然可以促使非成肌细胞融合成多核细胞。而且，当成肌细胞同时过表达Myomaker和Myomixer后，成肌细胞能够形成巨大的肌管。这些现象表明Myomixer是一个新型膜蛋白微肽，对细胞融合起到重要调控作用。该发现刊登于美国Science杂志。
Eric Olson实验室之前发现的两个微肽，Myoregulin 和DWORF对SERCA起到截然相反的调控作用。此次发现的微肽Myomixer对肌肉发育及分化又起到重要调控作用。这些发现说明微肽在生物体内的作用是不容忽视的。对生物发育，稳态调控，疾病生成都具有重要意义。
Dr.Z表示，“微肽毕竟就是一个蛋白质，只不过分子量比较小罢了。以前如果肽链小于一百，或者全部集中在一个外显子内，往往就被自动忽略了。现在用新的技术例如Ribosome Profiling就可以探测到之前被忽略的微肽。但是确认微肽是否真的具有生物功能和活性，还得运用体外转录、ISH、敲除、过表达等传统技术来确证。”
“目前很多微肽敲除之后，小鼠的Phenotype不是特别明显。当然最近发现的Myomixer 是例外，因为有Embryonic Lethality. 有时候微肽通过Transgenic 过表达，Phenotype虽然有的很明显，但是不能轻易下结论。因为很多微肽是膜蛋白，过表达之后本身就会造成Folding Problem，从而激活ER Stress以及Unfolded Protein Response Pathway.”
“所以我觉得有相当一部分微肽应该是起到微调的运用，也就是Fine Tuning. 能有明显表现型，如胚胎致死，估计少之又少。”
Citation:
1 http://www4.utsouthwestern.edu/olsonlab/research.html
2 Millay D P, O’Rourke J R, Sutherland L B, et al. Myomaker is a membrane activator of myoblast fusion and muscle formation[J]. Nature, 2013, 499(7458): 301-305.
3 Bi P, Ramirez-Martinez A, Li H, et al. Control of muscle formation by the fusogenic micropeptide myomixer[J]. Science, 2017: eaam9361.
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