研究Protein，这些技术不得不看
RNA最近几年可火了，RNA小鲜肉F4：miRNA、lncRNA、circRNA、piRNA，它们直接或者间接调节mRNA的翻译、基因转录，这些科研热点也成为做实验发paper的最爱，不管核心还是SCI，不管是CNS还是低分SCI，不管是灌水还是酝酿大招，不带个非编码RNA（noncoding RNA）研究机制在里面都不好意思投稿，不拉上miRNA感觉故事讲不下去，可以编码蛋白、正经干活的mRNA被冷落，大家纷纷开始喜欢遍布细胞各处的监工：非编码RNA(ncRNA)
诚然ncRNA确实成为近些年颜值较高、能来事儿、人见人爱的十大杰青之一，但归根结底还要和表型联系在一起，最终还是要通过蛋白质去实现表观遗传的本领，所以发大文章、走上巅峰，除了抱ncRNA的大腿外，蛋白质的分析功夫可不能丢，这不，X湿兄这几天就在温故而知新：蛋白质的常规检测技术。
那么，我们对蛋白质的哪些特点感兴趣呢？
（一）蛋白质的分子量、有无亚基？
（二）蛋白质的序列
（三）蛋白质的功能预测
（四）胞内蛋白质在哪里工作？胞外蛋白呢？
（五）蛋白质的磷酸化检测
（六）蛋白质-蛋白质相互作用
（七）蛋白质和DNA、RNA相互作用
（一）蛋白质的分子量、有无亚基
技术：蛋白层析、SDS-PAGE、Native-PAGE
当你发现一个未曾被报道过的蛋白质，想要知道它的分子量大小、有无亚基时，你可以做以下实验，如血红蛋白就是四聚体。
1) 天然蛋白的分离：蛋白层析法(这种情况较少)
也称分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex ged），下面这个品牌PharmaciaTM大家可以自行搜索一下，在蛋白层析界，那就是一拳超人般的存在，市场份额最大（小张说这是广告，要删了，但真不是广告啊）。
2) 重组蛋白的分离：6*HIS标签、GST蛋白标签等
想当年X湿兄做了多少次重组蛋白的纯化啊，一把辛酸泪呢！
大家都钓过鱼吧，重组蛋白就是利用这种原理
1. 池塘：大肠杆菌或哺乳动物细胞被诱导表达后混合物，目的蛋白(target protein)就在其中。
2. 鱼饵：能特异性吸附蛋白质头部或尾部的蛋白标签（例如HIS组氨酸标签被镍离子吸附）
3. 鱼竿：层析柱里面的凝胶填料，固相载体。
（请关注下期微信文章：重组蛋白纯化技术）
3) SDS-PAGE：变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS以及巯基乙醇，让蛋白质的高级结构完全瓦解，被严重蹂躏，变成直线棒状的蛋白质会在电场的作用下，在PAGE的网孔中穿梭向前跑，那些个头越小跑得速度越快，个头越大受到的阻力越大，跑得越慢，那么该组织或者细胞的蛋白质就会在PAGE的跑道上依次排开，你的蛋白质就可以通过已知的分子量个头大小进行分析。
4) Native-PAGE：不含SDS、巯基乙醇，蛋白质依然冰清玉洁
非变性凝胶电泳,也称为天然凝胶电泳,可以使蛋白质保持其天然的形状和电荷,与变性凝胶电泳最大的区别就在于蛋白在电泳过程中和电泳后都不会变性，所以亚基、高级结构啥的都保留下来。
SDS-PAGE：你大妈已经不是你大妈了！
Native-PAGE：你大爷还是你大爷。
（二）蛋白质的序列
技术：质谱、蛋白质测序
① 打个质谱小试牛刀--性价比高
每种蛋白质氨基酸序列都不同，所以蛋白质被打断后，产生的肽片段序列也不同，其肽混合物质量数即具一定特征性。用实测的肽段质量去查找蛋白质和核酸序列库，结合适当的计算机算法，可鉴定多肽序列。但这种方法不能用来直接测序，必须依靠大量的数据库信息进行比对，这种要比直接蛋白质测序要经济实惠。
② 蛋白质直接测序--成本很高
自然界中有些化学物质喜欢夺人所爱，霸占人家媳妇儿，有的喜欢N端的氨基酸残基，有的喜欢C端的，并巧取豪夺，利用这个原理，特异性地找到流氓，就知道哪个媳妇儿都夺走了，拼接出来完整的蛋白质序列。
（三）蛋白质的功能预测
蛋白质的许多特性可直接从序列上分析获得，如疏水性，它可以用于预测序列是否跨膜螺旋(transmenbrane helix)或是前导序列(leader sequence)。但是，总的来说，我们根据序列预测蛋白质功能的唯一方法是通过数据库搜寻，比较该蛋白是否与已知功能的蛋白质相似。
PROSITE（蛋白质家族及结构域数据库）：www.expasy.org/prosite/
PROSITE中涉及的序列模式包括酶的催化位点、配体结合位点、与金属离子结合的残基、二硫键的半胱氨酸、与小分子或其它蛋白质结合的区域等。
（四）胞内蛋白质在哪里工作？胞外蛋白呢？
技术：免疫组化(IHC)、免疫荧光技术、ELISA、ELISPOT
1) 免疫组化(IHC)：用标记的特异性抗体对组织内抗原的分布进行定位，相信有的同学都做到吐了，看到IHC这几个字儿都吃不下饭了吧；
2) 免疫荧光技术(Immunofluorescence)：以荧光物质标记抗体而对细胞中抗原进行定位的技术。
两者区别：IHC→组织；IF→细胞
3) ELISA、ELISPOT
1.ELISA：相信大家基本都做过，要想了解体液中某个蛋白的浓度，ELISA是首选，但是其不能定位到是哪个细胞分泌的胞外蛋白。
2.ELISPOT：基于ELISA的免疫原理，在体外细胞板孔内培养一群细胞，事先已经固定在板孔内的抗体可以捕捉到细胞生长过程中分泌的目标蛋白，显色后就能看得出来是哪些细胞分泌的目的蛋白，也就是定位，也可以半定量测定其浓度。
（五）蛋白质-蛋白质相互作用
技术：GST pull-down技术、Co-IP、酵母双杂交技术
1) GST pull-down技术：说白了就是钓鱼执法
将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。
2) Co-IP：Co-Immunoprecipitation
假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员，那么利用这种蛋白的特异性抗体，就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员，例如用WB的方法去鉴定。
A喜欢B，B喜欢C，最后ABC做了一个幸福的Co-IP实验
3) 酵母双杂交技术：搭鹊桥，牛郎织女来相会
酵母双杂交系统基于真核基因转录机制。真核生物转录因子GAL4含有二个不同的结构域：DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。但是它们两个分开，后面的基因是无法启动表达。GAL4 DNA-BD可识别DNA上的特异序列，并使GAL4 AD定位于所启动的基因的上游， GAL4 AD可同转录复合体的其他成分作用。
聪明的某个科研狗就把GAL4 DNA-BD上面安装上一把钥匙，GAL4 AD安装上一把锁，如上图所示，只有当他们的钥匙和锁是匹配的，GAL4 DNA-BD和GAL4 AD靠近了才能发挥功能，才能够正常地翻译目标蛋白。
成千上万的锁和钥匙一个一个试，只有正确匹配的锁和钥匙才能让牛郎和织女相会于鹊桥之上。
（六）蛋白磷酸化检测-一把车钥匙
技术有：激酶活性分析、磷酸化抗体Western Blot
蛋白质磷酸化（Protein phosphorylation）是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的机制。
蛋白质磷酸化主要发生在三种氨基酸上，丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸，因为其结构末端含有羟基，羟基很活泼，可以与磷酸基团结合。磷酸化就像是车钥匙，磷酸化就一路狂奔，去磷酸化就靠边停车(当然也有的磷酸化是抑制功能)。
WB大家都做过，可以半定量以及判断蛋白分子量
（七）蛋白质-核酸互作
技术：EMSA、ChIP、ChIP-CHIP、ChIP-seq、RIP-seq
蛋白和核酸互作，要么是DNA，要么是RNA。
那么蛋白质和DNA在一起能干什么呢？原因只有一个：蛋白质和DNA序列结合，是为了调控基因的表达，也就是表观遗传学的范畴。
真核生物的基因组DNA以染色质的形式(chromatin)存在。染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, ChIP）是目前最常用也是最有效的DNA与蛋白质相互作用的研究方法。如下图所示，用已知目的蛋白的抗体把蛋白-DNA复合物富集起来，拿去测序！
ChIP衍生出了好多应用：
① ChIP与基因芯片相结合建立的ChIP-CHIP方法，得到了高通量筛选；
② ChIP与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术，能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。
类似于ChIP，研究RNA和蛋白互作
①RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation），是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，能帮助发现miRNA、lncRNA的结合蛋白或者蛋白互作的ncRNA。
②RNA免疫共沉淀测序（RIP-seq），将RIP与二代高通量测序技术结合起来，在基因组范围内发现与蛋白或蛋白复合物相结合的RNA。
声明
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