这么做实验，想发低分都难
大家好，我是海明威，一个靠脸吃饭的男子，正好最近我听说很多童鞋中了基金，而且不知道该怎么花，如果你厌烦了测序芯片找lncRNA、circRNA→功能实验→分子机制，想试试一些新的课题思路，不妨看看此文。
最近我沉迷于CRISPR的海洋无法自拔，因为别人家的CRISPR为何总能发高分，而我们却只能用来做个基因敲除，灌水呢？我不服
CRISPR的基本作用除了基因敲入、基因敲除（Knockin、Knockout）外，还有基因干扰、基因激活、CRISPR高通量筛选（CRISPR/i、CRISPR/a、Screen）等，其在临床疾病上的科研应用非常广泛。
那么今天海明威就跟大家分享一下CRISPR能发高分的技术思路。
（一）新功能基因CRISPR高通量筛选
这样的工作量不小，但一般都是10分以上级别，当然也可以拆成几个低分的发一发。
进行全基因组功能基因筛选的一般流程可以归纳为
1.科学问题提出（例：耐药基因）
↓
2.建立稳定的细胞模型
↓
3.购买或构建文库
↓
4.制备含有文库的细胞
↓
5.用文库细胞进行细胞模型实验
↓
6.细胞基因组提取，获得sgRNA序列
↓
7.测序获得初筛基因
↓
8.基因功能验证
文章举例：
【Cell】Genome-wideCRISPR Screen in a Mouse Model of Tumor Growth and Metastasis.
问题提出：发现肿瘤基因组中调控肿瘤生长、肿瘤转移的相关基因
细胞模型：非小细胞肺癌(NSCLC)(KrasG12D/+;p53-/-;Dicer1+/-)；皮下注射（subcutaneoustransplant）
选择文库：mGeCKOa containing 67,405 sgRNAs（靶向20,611编码蛋白基因；1,175microRNA）
图：loss-of-function全基因组筛选肿瘤转移相关基因流程示意
图：验证候选基因流程示意及实验结果
（二）“阉割”的Cas9可做DNA抗体使用
将不具有核酸剪切活性的dCas9(deadCas9)与负责转录激活、转录抑制、表观调控和荧光表达等蛋白相融合，可以实现对靶基因的转录水平及表观遗传的调控，或对特定的DNA序列进行荧光成像和实时观察。
而这篇文章的作者，用“阉割”过的Cas9作为类似于抗体的特性，通过设计特异的sgRNA，将传统的金黄色葡萄球菌（MRSA）检测技术的时间大幅缩减到30分钟，灵敏度提高了5倍，经济成本居然还下降了，这样的创新无论哪个杂志都会喜欢的。
步骤如下：
MRSA病原菌基因组信息设计sgRNA→裂解MRSA基因组成为裂解液→sgRNA、dCas9和病原体裂解液混合→通过Ni+磁珠吸附dCas9-sgRNA-dsDNA复合物→用Sybr Green I荧光测定dsDNA浓度
（三）2017国自然中CRISPR项目
来看一下今年的CRISPR基金情况。
部分基金的标题一览：
运用基因打靶和CRISPR/Cas9技术构建原发性胆囊癌小鼠模型，80万；
利用CRISPR/Cas9高通量筛选技术研究超级增强子的功能，26万；
利用报告基因和CRISPR/Cas筛选技术研究Wnt/β-catenin信号通路的下游调节机制，24万；
利用CRISPR/Cas9系统对调控基因转录的顺式元件及反式因子的高通量筛选和鉴定，26万；
大规模CRISPR/Cas9基因组编辑研究干细胞多能分化性，60万；
基于CRISPR文库筛查技术的绒山羊毛囊干细胞增殖必需基因鉴定及功能研究，60万；
基于含铂高分子纳米胶束的癌症CRISPR/Cas9基因编辑治疗，63万；
全基因组CpG-SNPs与早发胃癌发病风险及其机制研究，60万；
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现F8在小鼠肝脏中的精准整合以治疗血友病A，55万；
基于非分裂神经元系统的CRISPR interference作用机制及应用研究，65万；
TUBB8基因在卵子成熟障碍患者群体中的遗传变异筛查CRISPR/Cas9介导的TUBB8突变小鼠基因治疗研究，56万；
应用CRISPR/dCas9技术介导miR-145调控间充质干细胞定向分化治疗老年ED的实验研究，55万；
运用CRISPR/Base editor技术调控Ku80分子跨核转运研究hsa-miR-623抑制非小细胞肺癌转移的机制，57万；
基于CRISPR/Cas9技术研究钠碘同向转运体在甲状腺癌放射性碘抵抗中的分子作用机制，48万；
CRISPR-Cas9系统介导的脂肪干细胞Sema3a表观遗传修饰用于促进2型糖尿病种植体骨结合的研究，56万；
利用CRISPR/Cas9技术构建D374Y-PCSK9转基因兔动脉粥样硬化易损斑块模型，52万；
新型CRISPR/dCas9介导的智能化基因线路精准治疗膀胱癌的实验研究，66万；
应用CRISPR/Cas9技术阻断伪狂犬病病毒潜伏再激活的研究，25万；
CRISPR-Cas9介导的免疫卡控点基因敲除的EBV-CTL在EBV相关胃癌免疫治疗中的应用价，21万；
......
长按二维码识别关注“小张聊科研”
关注后获取《科研修炼手册》1、2、3、4、5，基金篇、生信特辑