免疫荧光最全攻略：从protocol到问题解决

免疫荧光（Immunofluorescence）：简称IF，与western blotting一样，也是根据抗原抗体反应的原理，将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体或抗原上，与其相应的抗原或抗体结合后，在荧光显微镜下进行观察，从而确定抗原或抗体的性质和定位，包括直接法和间接法。

一、实验步骤

1. 样品准备（贴壁细胞、悬浮细胞以及组织等）

（1）对于贴壁细胞： 

先将洁净的盖玻片在70%乙醇中进行浸泡处理，然后用干净无菌的镊子放置到培养皿中，用无菌 PBS洗去残留的乙醇。待细胞接近长成单层后取出盖玻片，操作小心，防止细胞脱片。

（2）对于悬浮细胞： 有2种方法，

①先在悬浮液中进行固定步骤，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。

②先在悬浮液中进行固定和染色步骤，离心洗脱，然后用移液管移至盒式玻片进行后续染色步骤。

（3）对于冷冻切片：切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。 

（4）对于石蜡切片：免疫荧光中石蜡切片较少，要先进行脱蜡和抗原修复处理。 

2、 固定（防止离体组织自溶抗原扩散）

固定液包括：有机溶剂（甲醇、乙醇、丙酮等）；交联剂（4%PFA、10%中性福尔马林），固定液的选择取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性，不过，目前甲醛用的还是最多的，但针对磷酸化的抗体，不适合用甲醛，会导致磷酸蛋白从膜表面转移到胞浆中，故应选择冰冷的无水甲醇或无水乙醇，同时应注意甲醛会挥发，在4-8°C不宜储存太久。

固定时间：取决于组合块的大小和类型，对于大多数组织，18-24h较为理想，细胞固定时间较短，一般2%的甲醛室温固定20min即可。

以细胞样品为例：用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min。

3、通透（目的是使抗体进入胞内）

0.5%Triton X-100( 一种去垢剂，用PBS配制 )室温通透20min（针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则省略该步骤）；除了Triton X-100，丙酮也可作为通透剂，并且丙酮固定后的样品不需要通透。

4、封闭（减少一抗和二抗与非特异位点进行结合）

通透后用PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清，室温封闭30min。常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或者是羊血清。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。 醛类固定的样品，在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封闭液进行封闭。

5、一抗孵育

根据一抗的说明书，按照适当比例用一抗稀释液稀释一抗，用吸水纸吸尽封闭液，每张玻片滴加稀释好的一抗并放入湿盒， 4℃孵育过夜。回收一抗，加入PBST， 在摇床上缓慢摇动洗涤5min，共洗涤3次

6、荧光二抗孵育

用吸水纸吸尽洗涤液后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中孵育1h后，回收二抗，接着用PBST洗3次，每次5min；由于荧光容易淬灭，故从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都要避光。   

7、复染核（定位的关键）

在玻片上滴加DAPI，并注意避光孵育5min，对标本进行染核，然后用PBST洗3次，每次5min，洗去多余的DAPI；

8、封片及荧光观察：用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察。

二、常见问题

1、弱荧光信号

可能问题	解决方法
错误的激发波长	确保激发波长与荧光基团激发光波长相匹配
不兼容的一抗或二抗	注意种属问题
固定过度或不充分	适当调整时间
样本保存不当	注意避光
一抗不好用	建议做阳性对照确认抗体的有效性

2、高背景

可能问题	解决方法
洗涤不足	充分洗涤，适当增加洗涤次数
样本干燥	在湿盒中孵育抗体，避免样本干燥
封闭不充分	延长时间或更换封闭液
抗体浓度过高	预实验滴定，确认最佳浓度
二抗非特异性结合	不加一抗，只加二抗，作对照
样本自发荧光	提前检测样本自发荧光情况

3、细胞/组织形态被破坏

可能问题	解决方法
组织切片从玻片上脱落或切片有气泡	适当增加固定时间
组织切片撕裂或有褶皱	切割刀片不太锋利，考虑重新切片
细胞或组织固定不充分，自发裂解	适当增加固定时间，使用交联性固定剂

三、注意事项：对照实验的设置

1、 内源性组织背景对照：某些细胞和组织可能有固有的生物学性质，会产生背景荧光，对结果产生影响，例如色素脂褐质。因此在孵育一抗前，应对样品进行观察，确保抗原本身没有信号。

2、阳性对照：用确认含有待测抗原的组织或细胞，与待测标本进行统一处理，结果应为阳性，可证明待测抗原有一定活性并且实验过程中用的试剂及方法均可靠。

3、阴性对照：与阳性对照相反，用明确不含有待测抗原的细胞或组织切片染色，结果若为阴性，可排除染色过程中由于非特异性染色造成的假阳性结果。

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备注：入群学习

从以下20个热点入手，每天给大家分享干货：

1	miRNA非经典机制	11	肠道菌群
2	lncRNA的10种机制	12	细胞自噬
3	circRNA	13	细胞焦亡、铁死亡
4	单细胞测序	14	间充质干细胞
5	转录因子	15	肿瘤干细胞
6	可变剪接	16	外泌体
7	SNP	17	氧化应激
8	泛素化修饰	18	调节性T细胞
9	组蛋白修饰	19	RNA甲基化修饰
10	蛋白激酶和磷酸酶	20	肿瘤微环境

而这些研究方向参与疾病发生发展过程的分子机制，可以归纳总结为一下几类研究：

①分子（DNA、RNA、蛋白质、小分子）的表观遗传修饰；

②分子拷贝数的表达变化差异；

③RNA分子的剪接加工、出核、细胞组织水平的时空变化研究；

④特殊的一群细胞类型研究、细胞通讯微环境研究；

⑤具有临床应用潜力的新技术（CRIPSR）或者载体（膜结构、细胞等）；

⑥关注细胞生理学现象：自噬、凋亡、线粒体失功等；

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