入门级同学日常实验中容易忽略的小细节

一、 western blot篇

网站上讲WB的文章有很多，在这里，我主要是想给大家讲一下电泳仪的维护：整套电泳仪里最贵的部位也是最重要的部位就是正负电极和连接整体的电极丝。但是电泳液对电极是有腐蚀性的，不知道大家有没有注意过一点，当你电泳槽中注满电泳液时，电泳结束后，正负电极头的周围会有蓝色的沉积出现（如下图）

这就是电泳液腐蚀电极的表现。虽然这种现象短时间内不会影响蛋白条带的结果，但是时间久了，电极头腐蚀严重，可能会造成电极头断裂或者电阻增大。电阻增大，电流就会变小，蛋白条带跑的速度就会明显变慢，如果腐蚀较严重，电泳过程中就会发现电泳仪的温度可感知的升高，这不仅是对机器的损耗，也会造成蛋白的损失，不仅小分子蛋白降解，很可能连内参都跑不出来。所以我们在日常跑蛋白的过程中，我们要学会自检和维护电泳仪。

首先，自检！当出现以下情况时，很可能是你的电泳仪电极出现问题了：

1、 电泳时间比平时慢了很多，电流明显减小

2、 电泳过程中，肉眼可见蛋白条带从蓝色变成了黄色，并且长时间跑不下去（如下图）

（正常情况）

（出现问题）

3、 电泳仪下面的电极丝发黑

4、 电泳过程中，机器发热明显

日常维护中要注意的地方：

1、 每次使用完电泳仪要清洗干净，晾干，避免阳光下暴晒

2、 每次倒电泳液不要倒太满，只要保证浸透电泳槽内部胶，外侧导入三分之二即可，尽量不要让电泳液接触到电极头

3、 电泳仪的盖子和机器正负极不要插反

第二个小细节就是提取蛋白后加loading buffer煮沸这一步，我们都知道，loading buffer，也就是上样缓冲液，主要是起到指示（溴酚蓝）和蛋白沉积（甘油）的作用，6*，5*，4*的都有，根据最后蛋白的体积决定上样缓冲液加多少。这里要注意的是，在加入loading buffer后，要充分混匀，再煮沸。每次上样之前，要充分混匀离心。因为loading buffer的密度很大，每次加入蛋白中，会直接沉入试管底部，如果没有充分混匀，跑蛋白时很可能出现如下图所示的，蛋白条带中间分裂的结果，每组蛋白不能在同一水平线，会为后续结果分析带来困扰（这一点，是在制胶没问题的情况下）

既然讲到了western blot，怎么用ps处理后期的条带图？

1、 首先，刚开始做western blot实验的时候，因为没经验，急于在一块胶上跑出所有的蛋白，这样的操作很可能导致：a、每个蛋白留的条带太窄，作图不漂亮；b、蛋白不一定每次都在那个分子量，没有结果。所以尽量给每个蛋白条带留较大的空间，避免返工。

（这样的蛋白条带，截图出来，放在论文里就很难看）

2、 凝胶成像发光之后，我们可以通过机器调成对比度，也可以通过PS调整对比度和亮度，但是条带发光之后背景会泛蓝，这时候可以选择PS里的去色功能。

（原图）

首先要解锁图层，点击图像—调整—去色（快捷键shift+ctrl+U）。

3、 在文献中，我们会看到蛋白条带都是有边框的，点击编辑—描边，给蛋白条带加边框。

4、 接下来就是标注蛋白名称和分子量大小了。我们以下图为例，仔细观察会注意到，其实两条蛋白条带的长度是不一样的，为了整体的美观，可以通过标尺和裁减工具进行调整。

将标尺拉到需要裁减的边缘，点击左侧的矩形圈选工具，把想要裁减的部分圈选出来，点击删除即可。

之后就可以点击每个图层，描边了，然后书写蛋白名称和分子量大小了，习惯于将字体与条带对其，完成！

二、 细胞篇

刚开始养细胞的时候，很多人会根据培养基的颜色来决定是否换液。但是我觉得培养基的颜色有时候也是会蒙人的。不知道大家有没有注意到一点，有时候我们明明加入的4ml的培养基，但是当你换液的时候，只能吸出来2ml，虽然培养基的颜色并没有太大变化，但是液体量却减少了一半。其实这一点很好理解，细胞也是活的生物，自然是需要吃喝拉撒，培养基里最多的成分就是水，细胞在生长的过程中，不断的汲取水分，培养基的量自然会减少，里面营养成分的浓度也就跟着发生了变化，这可能就是培养基不变色的原因。所以不要以培养基颜色变化来决定是否换液，还是要通过观察镜下细胞的状态来判断。

最近经常会被师妹问到，为什么细胞每次提蛋白之后跑Western blot的结果会不同？同一种细胞，两次提取，同一个时间段变化趋势不明显或者相反？

我觉得在这一点上，除了可能是两次外界作用存在的差异外，大部分原因是在你提细胞蛋白的时候，无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，细胞状态不同。细胞状态是实验的前提。我们要选择处于对数生长期的细胞，进行加药处理，这样才能比较出对照组和实验组，实验组不同时间段下，药物或外界手段对细胞处理之后的影响，不然很可能会得到不一样的结果。那么怎么判断细胞是否处于对数生长期，我觉得不用把这个事情考虑成是一个计数的问题，你完全可以凭个人养自己的细胞时摸索出的经验来判断。无论是你从公司买来的细胞，还是从其他实验室借来的细胞，最开始的状态一定是最好的，当你养了一段时间，细胞状态稳定后，你就会发现，到底需要几天才会在培养皿或瓶中长满。同样体积的培养皿或培养瓶，这个天数应该是个固定值，就是我们在说明书中看到的几天传代一样，如果你的细胞超过这个天数还没有长满，很有可能就是细胞老化了（当然了，排除污染，营养不够这些个人原因）。

细胞老化后，很多蛋白表达量就会发生变化，比如说我们做EMT(上皮间质转化)，培养A549细胞（上皮细胞），A549老化后，会从最开始铺路石或者梭形的形状分化成细长条形状，表现出成纤维细胞的特点，正常来说，细胞会随药物作用时间的增长，EMT上皮细胞的表型减少，间充质细胞的表型增加，但如果细胞状态不好，0时也许就会出现间充质细胞表型的高表达。

(如图所示，两个指标都是间充质细胞的标志物，但是同样作用时间下表达趋势相反)

不管是什么细胞，不断地传代下去，终究会老化的，所以注意个人养细胞的手法操作可以减缓细胞老化的速度，我本人没有养过悬浮细胞，对于贴壁细胞来说，胰酶的浓度，消化时间，离心机的转速和时间，加有EDTA的胰酶用培养基中和后还要用PBS清洗以及吹打混匀的力度都是需要注意的地方，与此同时，我个人的习惯，复苏细胞长满一个皿后，一传二，一个冻存，一个用来做实验，这样就可以保证留种的细胞始终处于较好的状态。

总而言之，细节决定成败！