这个分子同期3篇最新nature，目测要火！！

6月17日Nature官网同时发表了3篇关于免疫的文章，这3篇文章都聚焦于同一个分子，是什么分子这么厉害，目测这是要火的节奏啊，大家赶紧来了解一下这个分子以及这3篇文章吧！

TOX reinforces the phenotype and longevity of exhausted T cells in chronic viral infection

我们先来看第一篇文章，第一篇文章的题目是“TOX reinforces the phenotype and longevity of exhausted T cells inchronic viral infection”，翻译过来就是“TOX分子在慢性病毒感染中强化了免疫耗竭细胞的表型及时长”，我们先来拜读一下这篇文章。

摘要：

在获得性免疫系统中，细胞毒性T细胞是抗病毒以及肿瘤免疫的必要分子，但是细胞毒性T细胞有一个特点，就是长期接触同源抗原，会导致细胞毒性T细胞的免疫效应减弱（是不是有点像免疫耐受！！），这也限制了T细胞的治疗潜能。而这个过程，就是所谓的T细胞耗竭/功能失调（T-cell exhaustion or dysfunction）；而这个过程会伴有调控细胞因子表达的表观遗传变化以及免疫抑制因子如PD-1的上调。但是至今研究者们对T细胞耗竭的产生以及维持机制仍然没有理解。而这篇文章，就报到了高剂量T细胞受体抗原刺激后，TOX蛋白显著高表达，且其表达和细胞耗竭表型密切相关。而TOX蛋白突变之后（移除其DNA结合结构域），PD-1表达下降，而细胞因子产生增加且体内产生了更多功能的T细胞。虽然TOX的突变起初会增强免疫效应，但是最终又会导致T细胞的减少，尤其是Tcf1阳性T细胞的减少。这篇文章发现TOX分子可以作为免疫T细胞耗竭产生的关键分子，同时也是慢性感染期间T细胞耗竭表型维持的重要分子；同时，这篇文章也将CD8+ T细胞的免疫抑制和机体防止免疫过度联系了起来。

下面我们稍加详细地过一遍这篇文章。

作者选用Lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV)病毒模型Armstrong和clone-13感染T细胞并进行多种表达谱分析，发现TOX分子属于显著差异表达分子（就这么选定目标分子了……可见生信分析多么重要！），然后作者就开始以TOX为靶标进行下述研究了。

作者首先发现，Armstrong的急性感染并不会诱导TOX表达的升高，但是clone 13的慢型感染会导致TOX表达升高，且clone 13的诱导效应依赖于数量而不依赖于抗原的亲和力（图1a）。作者还发现，慢性感染诱导的TOX表达升高，和其基因位点的低甲基化密切相关（图1b，这个地方也是一个大课题，可以参见第3篇文章）。

而作者还发现，TOX的表达量，和PD-1的表达正相关（图1c，图1d。看到没，到这里，一个故事就可以展开了……）。而在HCV的慢性感染中，即使用药，TOX的表达依然可以检测到（图1d）。

图1 

上述通过生信分析以及分子表达研究，基本上确定了研究方向。下面，就要开始常规的套路研究了（突变、相关性、共表达）。

作者将TOX的的第5个外显子突变掉，让其失去和DNA的结合能力，然后和wt进行对照研究。作者发现，慢性感染处理后，相比于wt，ToxΔ降低PD-1表达，提高KLRG1表达，且TNF和IFNγ的分泌都增加（图2a-d，都是免疫反应增强的表现）。而且，即使感染处理后第20天，提高表达的免疫因子数量反而更多了（图2e，说明免疫耗竭被维持了呗！）。

作者随后采用了Vβ5转基因小鼠，此小鼠对LCMV只有有限的免疫反应，让TOX以及ToxΔ突变体细胞转入小鼠体内，然后进行病毒感染，发现相比于wt，突变体小鼠血液和脾脏中的病毒滴度下降，而小鼠的体重严重下降（图2f-h）。（好了，这个地方转折来了，病毒滴度下降，鼠标不是应该更健康吗？怎么体重下降更多呢？）作者仔细检查小鼠的肺等组织，发现突变体组织有大量的坏死组织！

图2

作者进一步研究发现，在慢性感染中，虽然ToxΔ突变体T细胞一开始和wt差不多，但是随着时间增长，ToxΔ突变体T细胞就慢慢减少了（图3a）。也就是说，在慢性感染中，TOX分子是有利于T细胞存活的，而突变体长远来看，会导致T细胞死亡。

联系之前的文献报道，在慢性感染中，Tcf1⁺祖细胞是维持T细胞所必需的。作者检测发现，虽然在感染后第8天，ToxΔ突变体中Tcf1⁺祖细胞并没有减少，但是到了第20天，Tcf1⁺ T细胞显著减少（难怪T细胞减少了！）。结合作者其他实验结果，作者推测，Tox阻碍了Tcf1阳性细胞的增殖，但是并没有阻碍Tcf1阴性细胞的增殖。但是，Tcf1阳性细胞才是慢性感染免疫中需要的T细胞。

图3

作者发现Tcf1⁺ P14细胞Tcf1⁺ HCV-specific T细胞中，TOX和PD-1都是共表达的，但是ToxΔ突变体T细胞中，PD-1的表达是显著降低的（图4a-c），这些暗示了，ToxΔ突变体的生存缺陷，很有可能是因为PD-1被降低了表达。

根据文献，作者找到了Tim3作为细胞表面分子marker来特异性富集Tcf1阳性 T细胞（其TOX蛋白是高表达的），并对Tcf1 阴性和阳性细胞进行表达谱测序分析。分析结果表明，Tcf1阴性细胞下调了Sell和Ccr等免疫关键基因（图4d）；通路富集发现，ToxΔ突变体有不少细胞存活基因被下调而凋亡基因被上调。

图4

综上所述，可以看出TOX基因扮演了双重角色，一方面促进了免疫耗竭/功能失调，另一方面，TOX又可以作为T细胞长期生存和数量维持的关键因子。

好了，这篇文章大致可以使用下图进行概括：

TOX is a critical regulator of tumour-specific T cell differentiation

下面我们来简单看一下第二篇文章：“TOX is a critical regulator of tumour-specific T cell differentiation”，翻译过来就是“TOX是肿瘤特异性T细胞(TST)分化的关键调控因子”。

摘要：

TOX是肿瘤特异性T细胞(TST)分化的关键调控因子。TOX在肿瘤的功能障碍性TST和慢性病毒感染的耗竭T细胞中均高表达，并受慢性TCR刺激和NFAT激活的驱动。TOX在效应T细胞中的异位表达在体外诱导了一个与T细胞耗竭相关的转录程序的激活。肿瘤TST中Tox的缺失则使耗竭程序失效。TST中TOX的缺失不会上调抑制受体(如Pdcd1、Entpd1、Havcr2、Cd244、Tigit)，而保留了TCF1等转录因子的高表达。尽管免疫表型正常，TOX缺失的TST仍然功能失调，这表明抑制受体表达的调控与效应体功能的丧失是不耦合的。重要的是，尽管在急性感染时，TOX缺失的CD8 T细胞仍然正常分化为效应细胞和记忆细胞，但TOX缺失的TST在肿瘤中并没有持续存在。研究者们假设，在慢性抗原刺激(如癌症)的情况下，TOX诱导的耗竭程序可以防止T细胞过度刺激和激活诱导的细胞死亡。

研究思路：

TCR_TAG会表达抑制性受体，效应细胞因子缺失，且多数转录因子失常，研究者们于是分析了RNA-Seq发现编码核因子胸腺细胞选择相关的HMG盒蛋白Tox的基因高度表达，为了确定TOX在CD8 T细胞分化中的作用，研究者们首先用李斯特菌和肝癌注入小鼠体内，发现肿瘤组TOX表达增加，并伴随着许多抑制受体表达的增加和TCF1转录因子表达的降低。肿瘤和慢性感染中持续的抗原刺激可使T细胞表达抑制受体，促进其衰竭，因此研究者们又通过急性感染和慢性对比试验发现CD8 T细胞在慢性感染中TOX和抑制受体的表达量升高。NFAT是T细胞衰竭的关键调控因子，研究发现NFAT1与Tox 位点的区域结合并显着增加了染色质可达性，表明衰竭程序的启动受NFAT的激活。随后，又通过外源性表达TOX和基因敲除来确定TOX在CD8 T细胞衰竭中的作用。

总结全文，TOX在T细胞受到慢性抗原刺激的分化中是十分必要的。本研究的一个关键发现是在功能障碍的TST中，抑制受体表达的调控和效应子功能的缺失是解耦合的。

图例：

TOX在小鼠和人类肿瘤的肿瘤浸润性CD8 T细胞中均高表达。高TOX表达与多种抑制受体高表达、低TCF1等转录因子表达相关：

慢性TCR刺激驱动肿瘤特异性CD8T细胞中TOX的表达：

TOX的异位表达足以诱导T细胞耗竭的整体分子程序特征：

TOX缺失的T细胞的表型、功能、转录和表观遗传学分析：

TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8⁺ T cell exhaustion

最后我们来看一下第三篇文章：“TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8⁺ T cell exhaustion”，即 “TOX在转录和表观遗传学上可编程CD8⁺T细胞耗竭”。

CD8⁺ T细胞耗竭是慢性感染和癌症中T细胞发生的一种功能性障碍。耗竭CD8⁺ T细胞（T_EX）效应功能低下，耗竭的状态削弱了T细胞对感染和肿瘤的控制，导致慢性持续感染和肿瘤的发生。

与效应（TEFF）及记忆（TMEM）T细胞相比，T_EX不仅过表达大量的细胞表面抑制性受体、其转录表达谱和染色质的特征也发生了显著的变化。T_EX是一种独特的免疫子集，是检查点阻断和其他免疫疗法的重要指标，但控制T_EX转录和表观遗传的机制仍然未知。。。。

2019年6月17号，美国费城系统药理学和转化治疗学系E.John Wherry团队在Nature中发表了“TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8+ T cell exhaustion”研究成果。E.John Wherry团队在研究成果中提出了TOX作为耗竭CD8⁺T细胞（T_EX）的关键（中心）调节因子，并发现，CD8⁺ T细胞的耗竭与TOX的持续性高表达相关，并揭示TOX在T_EX表达转录和表观遗传发育过程中的调控作用。

1. 在T_EX的发展过程中，TOX转录水平上调表达

这些数据为TOX作为T_EX分化的中心节点的假设提供了证据基础。

Fig. 1 | Multiple epigenetic modulators, including TOX are selectively expressed in T_EX.

2. CD8⁺T细胞耗竭与高表达的TOX有关

TOX的表达与KLRG1+ terminal TEFF的发展负相关，而与高抑制性受体和T_EX相关，同时发现，肿瘤特异性TILs中TOX的表达与炎症细胞因子的产生呈负相关，表明TOX可能调节肿瘤中的T细胞功能。

Fig. 2 | Rapid and sustained TOX expression is associated with key features of exhaustion.

3. TOX在T_EX形成过程中的重要作用

总的来说，这些研究结果表明，TOX通过影响CD8⁺T细胞耗竭的关键发育因子来促进T_EX的产生，同时抑制KLRG1 + TEFF的发展。

Fig. 3 | TOX is required for the development of T_EX.

4. 钙信号转导和NFAT2是诱导TOX初始化

这些数据表明尽管初始TOX诱导需要NFAT2，但TOX表达和TOX依赖性T_EX程序一旦建立，仅依赖于钙调神经磷酸酶信号转导。

Fig. 4 | Calcineurin signaling and NFAT2 are necessary and sufficient toinduce TOX, but sustained expression becomes calcineurin independent.

5. TOX引发CD8⁺T细胞耗竭程序

研究数据表明，TOX能够诱导T_EX的转录程序。

Fig. 5 | TOX enforces a T_EX transcription alprogram.

6. TOX对T_EX的表观遗传编程

Fig.6| TOX induces an epigenetic signature of T_EX byrecruiting the HBO1 complex.

最后，作者鉴于T_EX的表观遗传编程机制还提出了基于TOX的调节和/或TOX依赖的表观遗传变化的新治疗可能性。从TOX的表达和TOX控制的分子事件可以更准确地检测、量化及评估T_EX，能够准确识别在肿瘤或病毒感染部位中的T_EX，从而通过重振T_EX来提高患者对癌症治疗的免疫反应。

怎么样，读的不过瘾的话，赶紧去下载原文献进行阅读吧！

 That's all, thank you!

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