膜不是一片黑就是一片白，明明目的条带只有一个，可是每次跑蛋白都能跑出好几条，有的离目的条带比较远相对好认，但有的离目的条带特别近，如果正好此处没有marker就更难认了，这里给小伙伴们盘点下这些究竟是什么原因造成的，方便大家找出自己的目的蛋白~ 这里注意查看抗体说明书，有的抗体可以识别同源性的蛋白，如果你的目的条带只有其中一条，可以查看两种蛋白相对分子量的大小从而确定位置，笔者所跑的这两个蛋白，1的分子量是76，2的分子量是82，从而可以确定上面的是2下面的是1。
另外一种情况是识别磷酸化的蛋白的，为了更精准地确定目的蛋白的位置，可以再孵一下总蛋白。以笔者常做的一个蛋白GSK3β举例：
再看应用部分就可知这个抗体既可以识别GSK3α在Tyr279的磷酸化，也能识别GSK3β在Tyr216位的磷酸化，抗体孵育结果如下，出来多条：
为了确定目的蛋白，洗去抗体再孵总蛋白GSK3β，结果如下，从而可以确定pGSK3β Tyr216的目的条带是位于下面的那条。
一种蛋白经过酶的剪切之后，抗体既能识别剪切前的也能识别剪切后的，但是这里需要注意了，虽然孵出了两个蛋白，但这两种目的蛋白的曝光条件可能不一样，笔者所做的两个蛋白，2min短曝显示的是酶剪切前的蛋白，剪切后的蛋白曝光条件为10min长曝。
如果你的目的蛋白分子量是80kd左右，跑出来的一张膜上在150、200kd分子量的marker附近位置处也显示有条带，那么可能的原因就是蛋白发生了二聚体/三聚体化。4. 前期（裂解、提取、煮蛋白等）操作不当导致蛋白降解或部分降解裂解时没有加入足够的蛋白酶或磷酸酶抑制剂、裂解后没有及时放在冰上，长时间暴露于室温下、煮蛋白不充分等等都可以导致蛋白降解，很典型的一个现象就是电泳、转膜条件等都无误的情况下膜上出现数条条带且无法分辨目的蛋白，连内参也是这样子，就只能重新提蛋白再做了。以下图为例，可能的原因是蛋白降解了一部分，未降解部分仍然可以和抗体结合就导致了多条带的发生。
如果内参条带十分好看，就只有目的蛋白出现这种情况，在排除抗体的原因后可能是裂解液出现了问题，可尝试着更换裂解液。不要总怀疑自己，跑出了好多条带，自己也懵了，没关系，可能目的蛋白就是这么多，如果少了反而不正确了，给大家看一个例子：
（图源文献：Upregulation of calpain activity precedes tau phosphorylation and loss of synapticproteins in Alzheimer’s disease brain）举个栗子，过表达一个蛋白，这个外源性的蛋白带有荧光基团或Flag，因为有了这些的“重量”，目的条带出来时会比内源性表达的位置稍微靠上。一抗、二抗都有可能，如果使用同样的二抗别的蛋白可以出来那就是一抗的锅了，看看你的抗体是否已经过期失效了，保存抗体的条件是否适合，购买渠道是否值得可信。这里给大家提个醒，笔者在实验室一抗都是回收用的，注意回收的也不能一直用，用几次就要换新抗体。洗膜时间不够，出现一片黑的情况时可以尝试延长洗膜时间，当然了，这里也要注意洗膜液是否新鲜未变质，如果洗膜液出现问题，蛋白也是要受到影响的。PVDF膜大概是我们特别容易忽略的一个关键因素。但是笔者遇到过，之前实验室买的便宜的膜不管孵什么蛋白背景都是黑黑的，后来查了很久才知道是PVDF膜的原因。（便宜的货慎用）1. 连marker也没有，最有可能的原因就是蛋白根本没转上，警告大家千万别把转膜的插头插反，红对红黑对黑，这是笔者血泪的教训。还有可能插头正负极正确，但是转膜时间过短。2. 有marker，看看抗体有没有孵对，是不是剪膜的时候把目的条带剪去了，抗体有没有失效，二抗的种属对不对，再去确认抗体孵育的时间和条件。2. 蛋白本身表达量很少，可尝试增加蛋白样品的浓度或上样量；4. 蛋白前期降解，如果是磷酸化的看看裂解时有没有加入足够的磷酸酶抑制剂；6. 转膜条件不合适，或者使用的膜孔径大小不合适。分子量比较小的蛋白一般选择孔径较小的膜。
关注后获取《科研修炼手册》1、2、3、4、5、6、7、8、9、10