2020年5月6日，丹娜法伯癌症研究院Adam Bass团队在Annals of Oncology上发表了题为Characterizing diversity in the tumor-immune microenvironment of distinct subclasses of gastroesophageal adenocarcinomas的研究，报道了GEA不同免疫亚型之间的差异，大多数GS亚型因为拥有三级淋巴结构（tertiary lymphoidstructures，TLSs）而更有可能适用于免疫疗法（答疑时刻：三级淋巴结构，是一种异位的淋巴器官，存在于包括肿瘤在内的非淋巴组织的慢性炎症部位，一般和预后存在正相关且有较好的免疫治疗反应，是癌症免疫治疗新途径）。大多数CIN亚型显示出T细胞排斥和巨噬细胞浸润，且免疫较差的CIN亚型存在MYC活性和CCNE1基因扩展（答疑时刻：MYC是较早发现的一组癌基因，；CNE1基因扩展被认为是增加非整倍体的刺激因子，而非整倍体性是一种肿瘤特征，所以，你懂得~~）。 2. 材料和方法1）病人数据：（1）TCGA数据：包含EBV亚型 (n=30), MSI 亚型(n=75), CIN亚型 (n=297), 以及 GS 亚型(n=51)。（2）FFPE样品：即福尔马林固定后石蜡包埋的组织，包含CIN亚型 (n=26) 和GS 亚型(n=18) ，MSI 亚型(n=14) 和EBV亚型 (n=13) 。2）免疫组化及免疫分析（1）数字化免疫细胞分析：可分别分析肿瘤边缘和肿瘤中心的免疫细胞(每mm2细胞数或染色强度)。（2）NanoString mRNA表达分析：对FFPE样本提取RNA并做表达量分析（答疑时刻：2008年《NatureBioteehnology》杂以封面文章形式报道了NanoString技术，此技术自动化程度高，反应中无需酶逆转及扩增的过程，避免了相关偏差，其检测敏感性、准确性和实时荧光定量PCR技术相当，但是通量相对更高，一个体系可以进行超过800个杂交反应~~换句话说，在准确性上KO芯片和高通量测序，在通量上KO定量PCR，就是不知道价格香不香？）。（3）基因组测序：对CIN亚型样本进行包含243个基因的目标区域靶向测序。（4）计算机分析：基于TCGA数据，使用TIMMER预测CD8+ T 细胞, CD4+ T 细胞, B 细胞, 巨噬细胞, 中性粒细胞和树突状细胞 (dendritic cells，DC)，使用聚类分析CD8及 CD4 scores来区分免疫冷热状态（hot and cold status）。（6）基因组注释：计算非整倍体分数，包含染色体臂水平的以及拷贝数变化。用GSEA对数据集进行注释。 3. 结果展示1）GEA不同亚型之间的免疫浸润存在显著差异为了评估不同亚型GEA的免疫相关肿瘤微环境，对TCGA数据进行了TIMMER分析，预测了CD8+ T 细胞, CD4+ T 细胞, B 细胞, 巨噬细胞, 中性粒细胞和树突状细胞 (dendritic cells，DC)的丰度，结果发现EBV亚型富含CD8+ T 细胞，而GS 亚型富含CD4+ T 细胞, B 细胞, 巨噬细胞，而CIN亚型所有的细胞类型相对含量都很低（这可能就是CIN亚型对免疫疗法不感冒的原因吧）。作者大概是怕有杠精怀疑他的生信分析结果，基于自己的组织切片样本，（1）通过免疫细胞计数发现MSI 亚型和EBV亚型的CD8+ T 细胞的密度较高，而免疫治疗效果不理想的CIN亚型和GS 亚型相对密度较低（来了一记实锤哦~）。（2）空间免疫组学发现EBV亚型的CD8+ T 细胞主要集中在肿瘤中央，而CIN亚型的CD8+ T 细胞主要集中在肿瘤的边缘部位（也就是说，对CIN亚型用免疫疗法，只能在边上小打小闹，根本攻不进肿瘤的核心区）（实锤+1）。（3）结合临床治疗效果，发现较好的PD-L1治疗效果总是伴随着较高的CD8+ T 细胞密度（实锤+2）。截止到现在为止，还一个NanoString mRNA表达分析的数据没用上，不能白做呀~~作者用这部分数据给所有样本做了个聚类分析，发现GS 亚型和EBV亚型以及许多MSI 亚型比较接近，而一半的MSI 亚型被聚到炎症反应较少的那个分支去了，这意味着MSI 亚型内部没有统一起来，存在异质性，且两个分支不存在年龄、性别、取样部位、CD8+ T 细胞丰度上的差异（事情的复杂度升级了，interestingly）。鉴于CIN亚型和GS 亚型对于免疫检查点抑制剂（ICI）的反应比较差，作者决定迎难而上，就把这篇文章剩余的火力都给集中在这两种亚型上了。
2）CIN亚型存在异质性的免疫微环境对CIN样本单独进行聚类发现，该亚型可以进一步分成两类，一类是炎症反应相对强烈的CIN-hot组以及对立的CIN-cold组，而上述我们提到过的免疫组织切片、数字化分析、免疫细胞位置的结果也支持这种分组结果。小组分好了，接下来就是找茬了，看看差异的点到底在哪。3）CIN-hot组和CIN-cold组的基因组差异分析还记得我们在方法部分提到的，对CIN亚型样本进行包含243个基因的目标区域靶向测序，就是在这部分起作用的，作者发现MYC基因的扩张伴随着CD8+ T 细胞和CD4+ T 细胞的减少（此强彼弱，结果就是朝着癌症的方向前进）。