文献解读|GEO数据挖掘助力发表7+分SCI文章
The following article is from i生信 Author 一无是处
生信数据挖掘发表SCI论文是过去比较火的研究模式，可是随着对文章质量要求的不断提升，目前想要通过纯生信数据挖掘发表高分的文章还是有一定的难度的，很多数据挖掘的文章不仅需要分析数据，还需要大量的实验，深入研究分子机制。当然，前期生信挖掘也是课题和研究思路的一种重要来源。一般常用的生信挖掘数据库包括GEO和TCGA，接下来我们就通过一篇7分的SCI论文，解读一下这篇文章是如何利用GEO芯片数据，结合新的研究热点，使用传统的分子机制研究手段，玩出新花样，收获高分文章！
文章发表于Molecular therapy Nucleic acids（IF=7.032），本文使用了两个GEO芯片数据集GSE61304和GSE59247，分别对应乳腺癌的mRNA与miRNA数据。本研究作者就是将生信数据挖掘与目前的研究热点“外泌体”结合在一起，创造出了不一样的效果。
研究背景
乳腺癌是一种女性恶性肿瘤，是全球最常见的癌症类型之一。癌相关的成纤维细胞（CAFs）可以通过调节细胞外基质的重塑和生长因子信号传导来调节肿瘤的转移，是肿瘤微环境中周围癌基质的关键因素。此外，CAFs还具有触发乳腺癌细胞上皮-间质转化（EMT）的能力。外泌体是大小在30到150 nm之间的小细胞外囊泡，几乎所有的细胞都可以分泌外泌体进入胞外环境。外泌体miRNA是公认的癌症治疗靶标和检测生物标志物，也有研究发现CAFs来源外泌体miRNA的失调与肿瘤的侵袭，转移和不良预后有关。
研究内容
作者通过对GEO芯片数据GSE61304差异表达基因分析，发现了一大批差异基因并作了功能分析，对其中已有研究的“connective tissue”相关基因分析发现HOXA5在乳腺癌中极显著低表达，对乳腺癌组织和细胞系中HOXA5基因的qRT-PCR定量以及免疫组化都证实了这一点。（这一部分通过实验验证了数据挖掘的结果）
作者比较了三种乳腺癌细胞系中HOXA5的表达量，发现其在MCF-7中表达最低，故而选择该细胞系进行接下来的细胞表型研究。过表达或敲减HOXA5，结果显示过表达HOXA5降低了MCF-7细胞的迁移、侵袭和增殖能力，促进了细胞凋亡，同时抑制了上皮间质转化过程，而敲减HOXA5则出现相反细胞表型，说明HOXA5基因低表达有利于乳腺癌的发生。（通过一系列细胞实验验证了HOXA5的功能，可以说是对数据挖掘结果的进一步验证和补充）
这一部分作者的思路比较巧妙，没有直接去找与HOXA5靶向的miRNA（估计找过了，不符合实验结果，没法继续做下去），而是将目标转向了转录因子CDX2。首先，通过网站预测发现CDX2能够与HOXA5启动子区结合，ChIP实验验证了这一点。随后，WB和qRT-PCR显示CDX2在乳腺癌中低表达，同时，研究发现过表达CDX2，HOXA5表达上调，敲减CDX2，则HOXA5表达下降。上述结果表明HOXA5的表达受转录因子CDX2调控。
作者在前面已经将思路引到了转录因子上，为了进一步研究CDX2在乳腺癌细胞中的调控方式，作者对乳腺癌相关的miRNA数据集GSE59247进行了差异分析，筛选出46个上调miRNA和92个下调miRNA。TargetScan预测发现只有miR-181d-5p与转录因子CDX2靶向结合。qRT-PCR显示miR-181d-p在乳腺癌中高表达，双荧光素酶实验证明miR-181d-p与CDX2之间的靶向调控关系。
既然发现miR-181d-5p与CDX2的关系，也发现它在乳腺癌中高表达，那么需要进一步研究miR-181d-5p的功能。作者首先通过原位杂交和免疫荧光技术发现miR-181d-5p在乳腺癌肿瘤间质高表达。随后，成功分离了乳腺癌组织中的CAFs和癌旁正常组织中的NFs，发现CAFs中miR-181d-5p的表达高于NF。为了进一步研究CAFs对乳腺癌的作用，将CAFs或 NFs的培养基（CM）培养MCF-7细胞，EdU实验说明CAF-CM促进了MCF-7细胞的增殖，而NF-CM对MCF-7细胞的增殖几乎没有影响。对EVmiRNA数据库（外泌体miRNA数据库）的检索发现，CAFs分泌的外泌体含有miR-181d-5p。因此，作者推测携带miR-181d-5p的CAFs外泌体可以促进乳腺癌的发展。为了证明这一假设，作者利用GW4869（一种神经酰胺类药物，常用于细胞外泌体分泌的抑制）抑制CAFs分泌外泌体，分析发现细胞增殖和凋亡现象消失，表明CAFs 外泌体能促进乳腺癌细胞的增殖，抑制细胞凋亡。
为研究外泌体的功能，作者分离并鉴定了CAFs来源的外泌体，荧光标记后进行共培养，证实了外泌体能被MCF-7细胞摄取。同时，结果显示过表达CAFs外泌体的miR-181-5p，MCF-7细胞的CDX2和HOXA5表达受到明显抑制，而敲减外泌体miR-181d-5p则出现相反结果，提示携带miR-181d-5p的CAFs外泌体可以转移至乳腺癌细胞，从而调节CDX2和HOXA5的表达。随后，一系列miR-181d-5p敲减/过表达（转染mimics或inhibitor）实验表明，携带miR-181d-5p的CAFs外泌体可以通过调节CDX2和HOXA5表达来增强乳腺癌细胞的增殖，侵袭，迁移和EMT，并抑制细胞凋亡。
前面做了一系列数据挖掘和细胞层面的实验，对于癌症研究，不得不最后落实在体内实验验证。因此，为了分析CAFs外泌体对体内乳腺癌生长和转移的影响，作者给裸鼠皮下注射MCF-7细胞以建立异种移植肿瘤模型，然后静脉注射CAFs外泌体，研究发现miR-181d-5p过表达的 CAFs外泌体促进肿瘤生长，抑制细胞凋亡，同时CDX2和HOXA5表达下调，而敲减miR-181d-5p则结果相反。上述研究结果表明外泌体miR-181d-5p抑制CDX2和HOXA5的表达，促进肿瘤生长。
以上就是文章的全部结果了，作者做了很多的内容，总体工作量较大。思路上比较新奇，作者将外泌体与数据挖掘巧妙的结合。总之，生信挖掘是源头，也是整篇文章的基础，但是主要是起到辅助，开路的作用，最重要的还是要利用生信数据挖掘寻找到的目标基因，设计新的研究思路和合理的实验，通过分子机制的研究来完善一个“研究故事”，才能发高分文章！
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