(文章篇)S3E1：新癌基因BAG2抑制MDM2介导的突变型P53泛素化

甲男：“我发现，我们之间关系就像分子间作用那样紧密、平凡。么么哒！”

乙女：“什么鬼？”

甲男：“我就是那MDM2，你就是让我疯狂的mutp53。我要让你给我生猴子。”

乙女：“你是个可人，你是个多情，你是个神仙也不灵。”

甲男：“为啥？”

乙女：“我的意中人是个盖世英雄，有一天他会踩着云彩来娶我。他，就是BAG2。”此处应有雷声。                  

突然发现 ，分子间的多角恋爱也忒多了。

BAG2 promotes tumorigenesis through enhancing mutant p53 protein levels and function

杂志：eLIFE  （IF 9.3）

时间：12/8/2015

作者及研究团队：本文的通讯作者Zhang zh所带领的课题组，主要从事p53、肿瘤抑制、能量代谢以及miRNA等相关研究。

背景：

p53基因突变（mutp53）产生的mutp53蛋白促进肿瘤发生发展，突变的p53蛋白不再能修复或命令损伤的细胞死亡，它们可以促进肿瘤的生长，当然这还要依赖mutp53蛋白积累到很高的水平。

 作者发现了一个定位于细胞核内的BAG家族成员BAG2，BAG2能在细胞核内结合mutp53蛋白，从而阻断MDM2与mutp53蛋白的结合；而MDM2作为E3泛素连接酶，通过结合mutp53介导mutp53的泛素化修饰和降解。BAG2与mutp53的结合解除了MDM2介导的mutp53降解，结果使mutp53蛋白在胞内累积，导致肿瘤生长、转移及耐药。

总结：

作者通过多个方面来验证BAG2与mutp53的作用，及其与临床的相关性。

首先，在肿瘤中BAG2的表达水平显著升高，而且BAG2越高病人预后越差；其次，作者发现在正常情况下，mutp53能被泛素化降解使其水平得到控制，也就是说在肿瘤细胞中mutp53的积累可能是由于其没有被泛素化降解。作者通过实验发现，mutp53能促使BAG2核转运，并与之结合，阻止mutp53结合MDM2被降解的命运。

这里有一个关键性的模块：泛素化，相关背景知识可参考：“小张聊科研”第一季：聊基金系列•第六期: 泛素化（快到碗里来！）

主要内容：

1.        验证BAG2是mutp53的结合蛋白

l  小鼠的胸腺淋巴癌中mutp53蛋白表达水平高于正常组织；

l  作者对mutp53进行IP（Immunoprecipitation，免疫共沉淀）实验，分析被一起拉下来的蛋白，鉴定到蛋白BAG2；

l  为了进一步验证BAG2与mutp53的结合，用BAG2抗体进行coIP-WB反向验证BAG2-mutp53的结合作用；

l  另外，在不同的细胞系中，作者也做了相关验证。明确了BAG2与mutp53的结合作用。

2.        验证BAG2和mutp53的作用域

作者通过研究发现，BAG2结合mutp53的各类突变蛋白的结构域，但不结合wtp53的蛋白结构域。已报道wtp53有两个转录激活域，一个DNA结合结构域（DBD），一个四聚化结构域，一个C端域。BAG2有一个BAG域。

作者分别用这几个域不同组合的表达载体BAG2-FLAG共转染到H1299细胞中，co-IP-WB验证，除了不含DBD域的细胞，均能检测到mutp53。所以BAG2通过BAG域作用与mutp53的DBD域。

实验中发现，只含有BAG域组的细胞拉下来的mutp53要少于完整BAG2组，作者认为可能是由于BAG2的N末端虽然不直接起到结合的作用，但它能影响复合物的形成。

3.        前期报道mutp53在细胞中的积累会促进肿瘤发生，所以作者想验证BAG2在肿瘤中能促进mutp53蛋白的积累作用。

• 作者从蛋白水平上验证了BAG2的敲减效率，并验证了BAG2敲减后mutp53蛋白水平与之正相关。

• 反过来，BAG2过表达后，细胞中mutp53的蛋白水平也随之上升。

这充分说明了BAG2蛋白水平的提升能促进mutp53蛋白的积累。

4.        验证BAG2如何调控mutp53水平

为了探索mutp53蛋白上调的原因，作者从蛋白水平进行相关原因探索，来源增加，抑或是降解减少，而泛素化修饰作为重要的降解方式之一，是作者关注的重点，在这里，作者发现BAG2能抑制MDM2对mutp53的降解。

• 在沉默了BAG2之后，对照组中的mutp53的水平明显降低；

• 反向验证，由于蛋白酶体抑制剂MG132抑制了蛋白酶体降解，明显地消除了因BAG2敲减后对mutp53水平产生的抑制作用；

• 在MDM2-mutp53（R175H）共转染细胞H1299中，高表达的MDM2又能下调mutp53蛋白水平。这说明MDM2能降解mutp53蛋白，而将MDM2-mutp53-BAG2共转染实验中可明显看到，mutp53蛋白水平有所回升。

敲减实验、共转染实验也证明了上述结论。

为了验证是否是BAG2抑制了MDM2对mutp53的降解作用。WB实验充分说明了BAG2能作用于mutp53蛋白，阻止它被MDM2泛素化降解从而实现mutp53蛋白积累。

5.     mutp53促进BAG2核转运。

 由于BAG2是一个胞浆蛋白，而高表达的mutp53蛋白主要存在于细胞核中。MDM2和mutp53蛋白一样，存在核定位信号（NLS）,处于细胞核中。BAG2只有进入到细胞核中才能结合mutp53使其免于被MDM2降解。免疫荧光实验可以看出，mutp53可以促进BAG2核转运，而wtp53蛋白则不起相关作用。WB实验也证实了存在mutp53的情况下，BAG2在核内的水平增加。

另外，作者做了一个反向验证。构建了一个NLS突变的mutp53，发现突变后的mutp53广泛存在于细胞浆中，同样容易和BAG2结合，但在核内检测不到了。所以，mutp53可以促进BAG2的核转运。

6.        化疗药物5-FU能促进细胞凋亡。

作者发现，BAG2敲减后的细胞经5-FU处理后，相对于没有敲减的对照组，细胞凋亡数显著增加。而对于wtp53细胞中，实验组与对照组细胞凋亡数量相差不是很明显。所以BAG2能促进mutp53使得细胞耐药。

7.        在细胞实验中，作者发现沉默了BAG2后，带有mutp53的细胞长得慢了，而不带mutp53的细胞生长速度变化不明显。这说明BAG2-mutp53跟细胞增殖有关系。动物实验中，在裸鼠尾部注射细胞后，能极大形成肺部转移瘤，并且mutp53-BAG2细胞接种的实验组裸鼠的肿瘤最大，与之相比mutp53-siBAG2形成的肿瘤要小很多。而在wtp53实验组中，细胞实验、成瘤实验的变化不是很明显。所以，BAG2能促进mutp53在细胞增殖、转移、肿瘤生长的作用。

8.        BAG2高表达的肿瘤病人预后很差。

作者通过上述实验发现，在肿瘤发生中BAG2通过结合mutp53蛋白阻止其降解。查询Oncomine数据库，得知基因扩增是肿瘤中BAG2过表达的关键机制。另外发现，BAG2过表达的肿瘤病人预后很差，所以BAG2表达水平可以指导预后评估。

全文下载链接（百度网盘）：http://pan.baidu.com/s/1jG9ztkU

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