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(文章篇)S3E7:一文掌握lncRNA研究的套路和创新点

2016-04-13 小张聊科研

大家好,在上期的文章中,我们分享了lincRNA-P21通过结合翻译调节蛋白Rck从而阻断CTNNB1和JUNB mRNA翻译,下调β-catenin 和 JunB表达水平的文章,今天继续分享一篇文章:

Chenguang Gong,Zhizhong Li,Krishnan Ramanujan,Ieuan Clay,Yunyu Zhang,SophieLemire-Brachat,and David J. Glass. A Long Non-coding RNA, LncMyoD, Regulates Skeletal Muscle Differentiationby Blocking IMP2-Mediated mRNA Translation. Developmental Cell. (July 27, 2015) (IF9.7)


我们从换个角度看同样是参与蛋白的翻译,本文的主角LncMyoD与lincRNA-P21的作用机制有何不同。首先上机制图:

吕小布LncMyoD是一条由MyoD临近基因编码的霸王lncRNA,在成肌细胞分化时直接由MyoD基因激活。原本貂小蝉IMP2(IGF2-mRNA-binding protein 2)与增殖基因董大卓(N-Ras、c-Myc)愉快地结合在一起,激活增殖基因转录,导致细胞增殖。而小霸王吕小布LncMyoD来了之后,发现貂小蝉IMP2蛮不错,直接抢先与之竞争性结合,打压貂小蝉IMP2之前介导的董大卓增殖基因的转录,使得细胞增殖受到抑制,促使细胞分化。


这篇文章的研究内容主要包括以下几点:

  1. 发现和鉴定LncMyoD,这一点我们看鉴定一条新的lncRNA,有哪些工作要做;

  2. LncMyoD促进成肌细胞分化,这部分简单说明;

  3. LncMyoD上调表达机制:被蛋白MyoD转录激活,这部分是蛋白与DNA作用的常见实验,前面已有文章涉及;

  4. LncMyoD下游抑制蛋白翻译机制,这点我们重点来看。


首先,是第一部分:LncMyoD的发现及围绕LncMyoD所做的相关工作:


即新lncRNA鉴定工作之“”八部天龙:

1. RNA-seq找差异lncRNA

2. 根据基因位置关系确定候选lncRNA 

3. RACE明确lncRNA序列 

4. lncRNA在细胞内的定位(空间特异性);

5. lncRNA在组织内表达特异性;

6. lncRNA表达的时间特异性;

7. lncRNA编码蛋白能力预测;

8. lncRNA编码蛋白能力验证;


以上八步骤基本涵盖了我们在做新lncRNA研究时需要了解的基本信息,其中第1和第2的内容是我们前面一篇文章(策略篇)千里挑一:挑选差异基因的七点策略”中的第一和第七点策略;第3点是明确lncRNA的序列和大小,因为lncRNA一般是大于200nt的;第4,5,6是研究的lncRNA表达的时间、空间和组织特异性;第7和8点是lncRNA不具备蛋白编码能力的生物信息学预测和实验结果。


另外,这部分还发现了LncMyoD的一个兄弟“LncMyoD*”,只不过在这篇文章中LncMyoD*不是主角,不过如果换个研究背景呢?说不定LncMyoD*就是主角了,如果LncMyoD*与LncMyoD的功能相同?相反?两者表达之间怎么调控?说不定是一个新的课题哦!


第二部分是LncMyoD促进成肌细胞分化的功能实验,这部分没什么好说的。


第三部分:LncMyoD与邻近基因MyoD的关系:MyoD介导LncMyoD的转录激活,从而上调LncMyoD表达。


我们在第一部分提到之所以挑选LncMyoD,除了因为LncMyoD表达上调外,还因为LncMyoD与基因MyoD位置上相近,而MyoD是参与成肌细胞分化的重要基因。那么位置上的相近仅仅暗示两者有调控,那么是LncMyoD调控MyoD?还是反过来?所以第一部分先确定两者是否存在调控,以及调控的上下有关系。结果表明:LncMyoD不影响MyoD表达,而MyoD影响LncMyoD表达,说明MyoD在LncMyoD的上游。然后预测到LncMyoD有多个MyoD的结合序列E-BOX(类似于HIF-1α对lincRNA-P21调节的文章中的HRE),后面用CHIP和荧光素酶报告基因实验验证MyoD对LncMyoD的转录激活,是我们以前说过研究转录因子常见的三大方法之二。


另外,如果LncMyoD同样激活MyoD表达呢?那么就是LncMyoD-MyoD正反馈回路了,实际上,由于LncRNA与基因位置接近而调控周围基因表达的例子还是比较多的,我们后面会选几种模式来介绍给大家。


第四部分:LncMyoD对下游基因的调控方式,这部分是我们说明的重点。


首先作者为了寻找LncMyoD调控的靶基因,通过RNA pulldown找到了IMP2蛋白,并且发现LncMyoD表达沉默后IMP2的表达水平被上调,那么LncMyoD是如何调控IMP2的水平的呢?结果发现IMP2的转录活性和蛋白稳定性都没有变化,有意思的是:IMP2的蛋白和mRNA能够直接结合,从而增加其本身mRNA的稳定性或翻译,而LncMyoD表达沉默增加了IMP2蛋白和mRNA的结合;然后,作者又发现LncMyoD除了能通过结合IMP2蛋白下调IMP2mRNA的水平外,还可以与其它结合IMP2蛋白的mRNA分子竞争结合IMP2蛋白,并下调其表达。


这一部分确定LncMyoD与IMP2蛋白作用的方法是RNA Pull downh和RIP实验,这是我们近几期每次都说的实验。值得一提的是,这里LncMyoD与包括IMP2蛋白本身的mRNA等竞争结合IMP2蛋白,从而下调靶蛋白的方式,与我们以前说过的聊基金系列•第三期: 竞争性内源RNA(敌之敌,即吾之友)很像,都是竞争某一类分子,但是结果是不同的,竞争性内源RNA(ceRNA)的机制里,lncRNA通过与靶基因的mRNA竞争结合microRNA,从而正向调节靶基因的表达;而在这里,lncRNA通过与靶基因的mRNA竞争结合一类蛋白,从而反向调节靶基因的表达,至于后面这种方式能否成为一种研究模式,还要看后续的研究。


好了,今天就到这里。如需看文献细节内容,请从百度云下载全文。地址:

http://pan.baidu.com/s/1i5FBrtN 密码:ave7



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