（文章篇）S3E7：一文掌握lncRNA研究的套路和创新点
大家好，在上期的文章中，我们分享了lincRNA-P21通过结合翻译调节蛋白Rck从而阻断CTNNB1和JUNB mRNA翻译，下调β-catenin 和 JunB表达水平的文章，今天继续分享一篇文章：
Chenguang Gong,Zhizhong Li,Krishnan Ramanujan,Ieuan Clay,Yunyu Zhang,SophieLemire-Brachat,and David J. Glass. A Long Non-coding RNA, LncMyoD, Regulates Skeletal Muscle Differentiationby Blocking IMP2-Mediated mRNA Translation. Developmental Cell. (July 27, 2015) (IF9.7)
我们从换个角度看同样是参与蛋白的翻译，本文的主角LncMyoD与lincRNA-P21的作用机制有何不同。首先上机制图：
吕小布LncMyoD是一条由MyoD临近基因编码的霸王lncRNA，在成肌细胞分化时直接由MyoD基因激活。原本貂小蝉IMP2（IGF2-mRNA-binding protein 2）与增殖基因董大卓（N-Ras、c-Myc）愉快地结合在一起，激活增殖基因转录，导致细胞增殖。而小霸王吕小布LncMyoD来了之后，发现貂小蝉IMP2蛮不错，直接抢先与之竞争性结合，打压貂小蝉IMP2之前介导的董大卓增殖基因的转录，使得细胞增殖受到抑制，促使细胞分化。
这篇文章的研究内容主要包括以下几点：
发现和鉴定LncMyoD，这一点我们看鉴定一条新的lncRNA，有哪些工作要做；
LncMyoD促进成肌细胞分化，这部分简单说明；
LncMyoD上调表达机制：被蛋白MyoD转录激活，这部分是蛋白与DNA作用的常见实验，前面已有文章涉及；
LncMyoD下游抑制蛋白翻译机制，这点我们重点来看。
首先，是第一部分：LncMyoD的发现及围绕LncMyoD所做的相关工作：
即新lncRNA鉴定工作之“”八部天龙：
1. RNA-seq找差异lncRNA
2. 根据基因位置关系确定候选lncRNA
3. RACE明确lncRNA序列
4. lncRNA在细胞内的定位（空间特异性）；
5. lncRNA在组织内表达特异性；
6. lncRNA表达的时间特异性；
7. lncRNA编码蛋白能力预测；
8. lncRNA编码蛋白能力验证；
以上八步骤基本涵盖了我们在做新lncRNA研究时需要了解的基本信息，其中第1和第2的内容是我们前面一篇文章“（策略篇）千里挑一：挑选差异基因的七点策略”中的第一和第七点策略；第3点是明确lncRNA的序列和大小，因为lncRNA一般是大于200nt的；第4,5,6是研究的lncRNA表达的时间、空间和组织特异性；第7和8点是lncRNA不具备蛋白编码能力的生物信息学预测和实验结果。
另外，这部分还发现了LncMyoD的一个兄弟“LncMyoD*”，只不过在这篇文章中LncMyoD*不是主角，不过如果换个研究背景呢？说不定LncMyoD*就是主角了，如果LncMyoD*与LncMyoD的功能相同？相反？两者表达之间怎么调控？说不定是一个新的课题哦！
第二部分是LncMyoD促进成肌细胞分化的功能实验，这部分没什么好说的。
第三部分：LncMyoD与邻近基因MyoD的关系：MyoD介导LncMyoD的转录激活，从而上调LncMyoD表达。
我们在第一部分提到之所以挑选LncMyoD，除了因为LncMyoD表达上调外，还因为LncMyoD与基因MyoD位置上相近，而MyoD是参与成肌细胞分化的重要基因。那么位置上的相近仅仅暗示两者有调控，那么是LncMyoD调控MyoD？还是反过来？所以第一部分先确定两者是否存在调控，以及调控的上下有关系。结果表明：LncMyoD不影响MyoD表达，而MyoD影响LncMyoD表达，说明MyoD在LncMyoD的上游。然后预测到LncMyoD有多个MyoD的结合序列E-BOX（类似于HIF-1α对lincRNA-P21调节的文章中的HRE），后面用CHIP和荧光素酶报告基因实验验证MyoD对LncMyoD的转录激活，是我们以前说过研究转录因子常见的三大方法之二。
另外，如果LncMyoD同样激活MyoD表达呢？那么就是LncMyoD-MyoD正反馈回路了，实际上，由于LncRNA与基因位置接近而调控周围基因表达的例子还是比较多的，我们后面会选几种模式来介绍给大家。
第四部分：LncMyoD对下游基因的调控方式，这部分是我们说明的重点。
首先作者为了寻找LncMyoD调控的靶基因，通过RNA pulldown找到了IMP2蛋白，并且发现LncMyoD表达沉默后IMP2的表达水平被上调，那么LncMyoD是如何调控IMP2的水平的呢？结果发现IMP2的转录活性和蛋白稳定性都没有变化，有意思的是：IMP2的蛋白和mRNA能够直接结合，从而增加其本身mRNA的稳定性或翻译，而LncMyoD表达沉默增加了IMP2蛋白和mRNA的结合；然后，作者又发现LncMyoD除了能通过结合IMP2蛋白下调IMP2mRNA的水平外，还可以与其它结合IMP2蛋白的mRNA分子竞争结合IMP2蛋白，并下调其表达。
这一部分确定LncMyoD与IMP2蛋白作用的方法是RNA Pull downh和RIP实验，这是我们近几期每次都说的实验。值得一提的是，这里LncMyoD与包括IMP2蛋白本身的mRNA等竞争结合IMP2蛋白，从而下调靶蛋白的方式，与我们以前说过的“聊基金系列•第三期: 竞争性内源RNA（敌之敌，即吾之友）”很像，都是竞争某一类分子，但是结果是不同的，在竞争性内源RNA（ceRNA）的机制里，lncRNA通过与靶基因的mRNA竞争结合microRNA，从而正向调节靶基因的表达；而在这里，lncRNA通过与靶基因的mRNA竞争结合一类蛋白，从而反向调节靶基因的表达，至于后面这种方式能否成为一种研究模式，还要看后续的研究。
好了，今天就到这里。如需看文献细节内容，请从百度云下载全文。地址：
http://pan.baidu.com/s/1i5FBrtN 密码：ave7
That’s all. Thank you!
请关注“小张聊科研”：搜索微信号“xzlky2015”，或长按二维码识别关注。
↓↓↓