CRISPR，不仅仅是基因编辑工具|视频

即使你不是学生物的，想必你也听说过现在炙手可热的CRISPR技术，但它并不只是一种基因编辑技术，今天的视频与文章，希望可以帮助你更加深入的了解CRISPR。

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原文以CRISPR: gene editing is just the beginning为标题

发布在2016年3月7日的《自然》新闻特刊上

原文作者：Heidi Ledford

该生物工具的真正力量在于探索基因组的作用方式。

无论何时，只要一有关于CRISPR-Cas9的论文发表，Addgene的员工立刻就会发现。Addgene是一家非营利公司，研究作者们常常将工作中用到的分子工具存放在这里。一旦有可用工具，别的科学家立即就会知道。科学家还会在第一时间来此拿取试剂。“一篇热门论文发表后，不用几分钟我们就会接到电话，”公司的执行理事Joanne Kamens说。 

分子生物学家乘着CRISPR掀起的一股新科技巨浪奋勇向前。

Ryan Snook

2013年初，有研究人员首次报告称他们使用CRISPR-Cas9系统在目标位置切下了一段人类细胞基因组。自此之后，Addgene的电话就常常响起。“它吸引了所有人的目光，”Kamens说。从那时起，分子生物学家都迫不及待地采用这种技术，它可用来改变几乎所有有机体的基因组，其操作的简便性是前所未有的。Addgene已经将60,000个CRISPR有关的分子工具——大约占其总出货量的17%——送到83个国家或地区的研究人员手中。2015年，公司有关CRISPR的网页的浏览量超过100万次。

大多数有关CRISPR-Cas9的对话都围绕其治愈疾病或编辑人类胚胎基因的能力展开，但是研究人员表示真正的革命此刻正在实验室中进行。CRISPR的独特之处，也是生物学家所追求的是特异性：靶向基因组茫茫DNA序列中的特定序列。编辑DNA只是它的功能之一。科学家正在试图修改该工具，以便将蛋白质传送到准确的目标DNA，控制基因的开关，甚至是改造整个生物电路——他们的长期目标是理解细胞系统和疾病。

“对于资源有限的分子生物学家来说，这的确是一种特别强大的研究基因组的方法。”美国波士顿儿童医院的血液学家Daniel Bauer说。“它有助于解答许多之前无法回答的问题，非常有意思。”南加利福尼亚大学的分子生物学家Peggy Farnham补充道。

在本文中，《自然》从五个方面介绍CRISPR-Cas9正在如何改变生物学家研究细胞的方法。

断裂的剪刀

CRISPR-Cas9系统有两个主要成分：一个是Cas9酶，它像一把分子剪刀一样剪切DNA；还有一个是RNA小分子，它将剪刀引导至特定的DNA序列来执行剪切。细胞固有的DNA修复机制一般能修复断裂——但常常出错。

仅仅这一点，对于想要通过沉默基因来研究基因功能的科学家来说便是一个好消息。遗传密码毫无仁慈之心：修复过程中出现的一个小小错误就能彻底改变它编码的蛋白质的序列，或干脆中断蛋白质生产。于是，科学家可以研究当蛋白质或基因被沉默时，细胞或有机体会发生什么。

但是还存在另一条修复路径，它有时候根据DNA模板修复断裂处。如果研究人员提供模板，他们几乎可以编辑基因组任何位点的任何序列。

2012年，很多实验室争相证明这些基因编辑工具在剪切人类DNA方面的表现。有一支团队决定另辟蹊径。“我们做的第一件事是弄坏剪刀。”加州大学旧金山分校（UCSF）的系统生物学家Jonathan Weissman说。

Weissman从斯坦福大学的合成生物学家Stanley Qi那里了解到这种方法。Stanley Qi使Cas9酶发生突变——仍旧能够在向导RNA所引导的位置与DNA结合，但是不再进行剪切。酶停留在那里，阻断其他蛋白质将该DNA转录成RNA。这样一来，科学家可以在不改变DNA序列的情况下，沉默基因。

接着，该团队利用这个失活的Cas9尝试新的实验：研究人员将它与另一种能激活基因表达的蛋白质结合在一起。再加上其它一些调整，他们就能够随意“开关”基因。

现在，已有多家实验室在此基础上推陈出新，另外有更多的实验室奋力直追，将其拿来为己所用（参见“改造CRISPR”）。一种流行的应用是迅速生成几百种不同的细胞系，每一种包含一个不同的向导RNA，靶向特定基因。UCSF的另一位系统生物学家Martin Kampmann希望筛选出这类细胞，以了解开关特定基因是否会影响暴露在毒性蛋白质聚集体下的神经元存活——一种涉及多种神经变性疾病（包括阿尔茨海默病）的机制。

Kampmann之前使用RNA干扰（RNAi）开展类似的筛选，该技术也能沉默基因，能够一次处理大量分子，但是也存在弊端。他解释说：“RNAi就像是霰弹枪，大家都知道它的脱靶效应。而CRISPR则是让你可以精准操作的手术刀。” 

Nik Spencer/Nature

Weissman及同事（包括UCSF的系统生物学家Wendell Lim）进一步调整方法，使其依赖于更长的向导RNA，其基序与不同的蛋白质结合。这允许他们在一个实验中在三个不同位点激活或抑制基因。Lim认为该系统能够一次处理最多5个位点。他说这个系统的限制或许是有多少向导RNA和蛋白质能够被塞进一个细胞中。“到头来，还是有效负荷的问题。”

麻省理工学院的合成生物学家Ron Weiss就被这种组合能力吸引，投入到CRISPR-Cas9的热潮中。Weiss和同事也在单个实验中实现了对多个基因的调控，由此他们能够更快更简便地建造复杂生物通路，其中一些能够将细胞的代谢机制转变为一座生物燃料工厂。他说：“合成生物学最重要的目标是通过创建精密通路来构建复杂行为。”

CRISPR表观遗传学

当遗传学家Marianne Rots刚开始工作时，她怀揣着开发医疗新技术的理想。她以前研究基因疗法——以疾病中的突变基因为靶点。但是几年后，她却决定改变研究方向。现任职于荷兰格罗宁根大学医学中心Rots说：“我认为许多疾病源于基因表达谱被扰乱，而不是我之前一直研究的单一基因突变。”她认为控制基因活性的最好方法是调整表观基因组，而非基因组本身。

表观基因组是添加在DNA和组蛋白上的化合物集，它们能调控基因的表达。这些标记随着时间推移而发生变化：随着个体的发育和环境变化，它们被添加或移除。

在过去的几年里，上百万美元被投入用于编录不同人体细胞中的表观遗传标记。从大脑活动到肿瘤生长，一切都与它们的模式相关联。但是因为缺乏改变特定位点标记的工具，研究人员无法确定这些标记的变化是否会导致生物变化。“这一领域遇到了许多阻力，因为我们没有遗传学家的那些工具，他们可以直接测试某个基因的功能，”美国阿拉巴马大学伯明翰分校的神经科学家Jeremy Day说。

CRISPR-Cas9可以改变这一局面。2015年4月，美国杜克大学的生物工程师Charles Gersbach和同事公布了一个用于将乙酰基（一种表观遗传标记）添加至组蛋白的系统，该系统利用断裂的剪刀将酶携带至基因组的特定位点。

Gersbach团队发现，向与DNA关联的蛋白质添加乙酰基足以大幅度增加靶基因的表达水平，这证实了该系统的有效性，并且证实该位点的表观遗传标记具有激活基因表达的功能。论文发表后，Gersbach将他的酶存放在Addgene以供其他研究组使用——很快就有人这么做了。Gersbach预测将会有一大批论文显示，当多个表观遗传标记被同时被操控时会产生协同作用。

这些工具需要进一步完善。有十几种酶能够在DNA上添加或删除表观遗传标记，但并非所有的都适合采用断裂的剪刀方法。Gersbach说：“它其实比许多人想象的更难操作。你将许多东西添加到一个失活的Cas9上，但它们不一定发生作用。”有些时候很难判断一个意外结果的出现是因为实验方法不当，还是因为这个表观遗传标记在特定细胞或环境中不起作用。

Rots之前使用旧的编辑工具锌指蛋白来探索癌症相关基因上的表观遗传标记的功能，现在则采用CRISPR-Cas9。她说新工具使该领域大众化，并且已经产生广泛的影响。人们曾经说关联纯属巧合，也就是说如果你改变表观遗传，它对基因表达不会有任何影响。“但是现在，这并不难测试，许多人正加入这个领域。”她说。

CRISPR代码破译

DNA上的表观遗传标记不是唯一有待破解的基因组密码。超过98%的人类基因组不编码蛋白质，但是研究人员认为很多非编码DNA也有重要作用，他们正在利用CRISPR-Cas9研究这些作用到底是什么。

部分DNA编码RNA分子，如microRNA和长链非编码RNA，科学家认为它们除了制造蛋白质外还有其他功能。另一些序列则是能够增强特定基因表达的“增强子”。大多数与常见疾病有关的DNA序列存在于包含非编码RNA和增强子的基因组区域。但是在CRISPR-Cas9出现之前，研究人员很难确定这些序列的功能到底是什么。Bauer说：“我们没有解释非编码基因组功能的好办法。不过现在我们的实验要精密得多。”

Farnham及同事利用CRISPR-Cas9删除与前列腺癌和结肠癌相关的突变增强子区域。有时得到的结果让她惊讶。在一项未发表的实验中，她的团队删除了一个被认为具有重要作用的增强子，但与它相邻的一百万个碱基中没有基因发生了表达变化。她说：“有时候我们删除一个调控元件，结果发现它产生的实际影响和我们按照常规方式划分的影响程度不一样。”

随着研究人员越来越多地利用CRISPR-Cas9研究大量调控DNA，他们可能会发现更多意外结果。麻省理工学院的遗传学家David Gifford和波士顿布莱根妇女医院的Richard Sherwood带领研究小组，使用该技术在一个40,000碱基长的序列中引入突变，然后检查是否每一个突变都会对附近产生荧光蛋白的基因的活性造成影响。他们最终得到了一张增强基因表达的DNA序列图，其中包括一些基于基因调控特征（比如染色质修饰）没有预测到的序列。

即使使用CRISPR-Cas9，要深入研究这一神秘领域仍存在挑战。Cas9酶会在向导RNA引导的位点进行切割，但是切割位点附近需要存在一个常见却特异的DNA序列。这对于想要沉默基因的研究人员来说不是个大问题，因为这些关键序列几乎总是存在于目标基因内的某处。但是对于那些想要在短链非编码RNA上做特异性修饰的人而言，选择较为有限。“我们不能随随便便使用一个序列，”荷兰癌症研究院的研究员Reuven Agami说。

研究人员正在细菌王国里寻找能够识别不同序列的Cas9酶的近亲。去年，哈佛-麻省理工学院博德研究所张锋的实验室表征了Cpf1酶家族，它们和Cas9的作用相似，从而有望增加可用的序列选项。但是Agami指出，目前发现的替代酶很少有能和最受欢迎的Cas9相媲美的。他希望能在未来找到完整的酶工具集，可以靶向基因组的任何位点。他说：“我们还有很长的路要走。”

CRISPR与光

Gersbach的实验室利用基因编辑工具来了解细胞命运及其调控：团队希望有一天能在培养皿中培养用于药物筛选和细胞治疗的组织。但是CRISPR-Cas9的效果是永久性的，而Gersbach团队需要瞬时打开和关闭组织特定位置的基因。“血管的脉络生成需要精密的控制，”他说。

Gersbach及同事采用断裂的、但经过修饰的剪刀——可激活基因的Cas9，并在上面添加可被蓝光激活的蛋白质。这样所得的系统能够在细胞暴露于蓝光下时触发基因表达，而在关闭蓝光时停止基因表达。由日本东京大学化学生物学家佐藤守俊领导的一个研究小组建立了一个类似的系统，且同样制造出一个活性Cas9，只有当暴露在蓝光下时它才会编辑基因组。

其他人通过将CRISPR与某种化学开关结合起来，取得了类似结果。纽约威尔康奈尔医学院的肿瘤遗传学家Lukas Dow想要使成年小鼠的癌症相关基因发生突变，以重现在人类结直肠癌中发现的突变。在该团队制造出的CRISPR-Cas9系统中，一剂强力霉素可以激活Cas9，使其剪断靶标。

这些工具将人类向完全控制基因组编辑又推进了一步。Gerbach的团队还未诱导血管的脉络生成：目前，他们正在全力优化他们的光诱导系统。“这是第一代工具，”Gersbach说。

CRISPR模型

癌症研究员Wen Xue在他博士后研究之初潜心培养出一只携带人类肝癌相关突变的转基因小鼠。这一路上他举步维艰：先要制作基因靶向所需的工具，再将它们注射进胚胎干细胞，然后试图让小鼠产生变异。他所付出的代价是：一年的时间和2万美元。“那是研究疾病基因过程中的限速步骤。”他说。

几年后，就在他要启动另一项转基因小鼠实验时，他的导师建议他尝试CRISPR-Cas9。这次，Xue订购了工具，将它们注射进单细胞的小鼠胚胎，几周后大功告成！“我们一个月就有了一只转基因小鼠，真希望我早点就用上了这项技术。这样我的博士后时间会大大缩短。”Xue说。

从癌症到神经退行性疾病等各领域的研究人员都在使用CRISPR-Cas9建立疾病动物模型。CRISPR-Cas9提高了基因调控的精细程度，并扩大了可编辑的物种范围。Xue目前在马萨诸塞大学医学院有自己的实验室，他正在利用CRISPR/Cas9在细胞与动物突变模型上系统地筛选肿瘤基因组数据。

研究人员希望组合使用这些新的CRISPR-Cas9工具来精准操控动物模型中的基因组与表观基因组。Dow说：“当这些系统融合时才会发挥出真正的力量。”这或有助于科学家捕捉和理解人类常见疾病的某些复杂面。

拿肿瘤来说，它们可能包含几十种会助推癌症发展的突变。“在建立肿瘤模型时，不是所有突变都是重要的，但是如果要建立恶性程度高且较为接近人类癌症真实情况的模型，研究者则需要在模型中引入2-4个突变。”Dow说。他还说，如果使用传统方法把所有突变引入小鼠中，不但成本高而且耗时长。

生物工程师Patrick Hsu于2015年在加利福尼亚的索尔克研究所建立了自己的实验室；他计划利用基因编辑建立阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性疾病的细胞和狨猴模型。这可以比小鼠模型更加有效地展现人类行为和疾病发展，但是这在CRISPR-Cas9技术问世之前极其昂贵和耗时。

在设计实验以便对他的第一只CRISPR-Cas9绒猴进行遗传改造时，Hsu就已经意识到，这个方法可能只是通往未来的一块垫脚石。“科技发展后浪推前浪。你不能死守一个不放。你必须一直思考还有什么生物问题亟待解决。”他说。ⓝ

Nature|doi:10.1038/531156a

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