魔高一尺，道高一丈︱看破肿瘤如何逃脱化疗

原文作者：Karen Gomez & Raul Rabadan

理解化疗耐药性的发生过程，有助于进行更好的抗癌治疗。这种耐药性的来源是肿瘤耐药细胞。一种详细描述肿瘤耐药细胞的方法可阐明其起源。

如果一小组肿瘤细胞在化疗中存活，即产生耐药细胞（persister cells，或称持久细胞），那么肿瘤就会复发。多数耐药细胞在药物作用时是不分裂（静止）的，但其中很小的一群，能在治疗时就重新进入细胞周期，进行增殖。已有许多研究关注这种抗治疗背后的遗传机制，但越来越多的数据显示，非遗传机制（比如DNA和称为染色质的蛋白质复合物的变化）也在耐药细胞的发展过程中有一定作用。Oren等人[1]采用了一种名为DNA条形码的技术，检测了耐药细胞的细胞谱系和基因表达谱，得以追踪肿瘤细胞及其子代，该文章发表在《自然》上。他们的结果阐明了在多种组织的多种肿瘤中，可逆的非遗传机制在化疗耐药性方面发挥的作用。

作者分析了体外培养的人肺癌细胞的细胞分裂过程。该细胞在编码表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因上带有突变。这些细胞用EGFR抑制剂奥沙替尼（osimertinib）进行了处理。Oren等人追踪了肿瘤细胞系的谱系结局，14天后发现有8%的细胞系长成了耐药细胞，并有13%的耐药细胞重启了细胞周期，增殖形成细胞群。以上结果显示，循环和非循环耐药细胞都在治疗过程早期就出现了，并且衍生于几个单独的细胞系。

为阐明循环和非循环耐药细胞相关的分子机制，作者设计出了一套他们称为“西瓜”（Watermelon）的系统，这套系统能同时追踪每个细胞的谱系、增殖状态和转录状态（图1）。作者还想确定耐药细胞的耐药态是否产生于其不可逆的遗传性质，所以在治疗暂停一段后，重新用奥沙替尼处理耐药细胞群。他们发现循环和非循环耐药细胞都重新获得药物敏感性，表明耐药性背后存在着一种可逆的非遗传机制。

图1 | 分析肿瘤耐药细胞的方法。Oren等人[1]展现了他们的“西瓜”技术，用以分析耐药细胞——在类似奥沙替尼这类化疗药的破坏下逃逸的肿瘤细胞。作者在体外培养的人肿瘤细胞中引入了一段设计好的DNA序列。这段序列中包含了一个特有的DNA“条形码”，能确定该谱系下的细胞；还包含了编码绿色荧光蛋白（mNeon）和红色荧光蛋白（mCherry）的基因各一个，后者需要多西环素诱导表达。然后作者用奥沙替尼和多西环素处理细胞，并用单细胞技术分析活下来的耐药细胞。非循环（不分裂）比循环（分裂）的耐药细胞mCherry表达水平更高。耐药细胞中含有能造成氧化损伤的活性氧（ROS）。与非循环耐药细胞相比，循环耐药细胞ROS水平更低，氧化脂肪酸水平更高。而且循环耐药细胞显示了多种抗氧化特征，其中包括表达抗氧化分子和转录因子NRF2。

作者之后用单细胞RNA测序方法，检测了两周内不同时间点的基因表达情况，并比较了循环和非循环耐药细胞的这些特征。循环耐药态的特点是上调产生抗氧化分子的防御程序——包括表达抗氧化分子谷胱甘肽代谢的特征，还产生蛋白质NRF2，一种应对氧化应激时诱导产生的转录因子。不仅如此，几种NRF2的靶点基因，其表达和下有大量子代耐药细胞的谱系相关。而细胞经基因工程去除了一个NRF2的负性调控基因后，会导致循环耐药细胞比例上升。

用奥沙替尼处理细胞，会诱导其产生活性氧（ROS），从而引起氧化应激。处理期末，循环耐药细胞ROS水平显著低于非循环耐药细胞。作者加入了ROS清除分子，降低细胞内ROS水平后，循环耐药细胞比例上升。因此，以上分析表明，细胞氧化还原态在调控循环耐药细胞中发挥作用。

认识到氧化还原平衡跟代谢相关后，作者绘制了循环和非循环耐药细胞的代谢产物谱，从而确定了在这两种细胞中丰度不一的56种产物。他们发现，对比非循环态细胞，与肉碱（脂肪酸氧化准备步骤的产物）相关的脂肪酸在循环态细胞更丰富。他们还注意到，奥沙替尼处理会导致脂肪酸氧化增加。改变脂肪酸氧化通路的结果显示，增加或降低脂肪酸氧化会分别提高或减低循环耐药细胞比例。这些结果支持了以下理论：改变脂肪酸氧化代谢，会影响耐药细胞的增殖能力。

Oren等人想测验他们的发现是否能推广到肺癌以外的模型系统，从而创造了其他人类肿瘤的“西瓜”模型，包括黑色素瘤、肺肿瘤、乳腺肿瘤、结直肠肿瘤。他们根据特定肿瘤背后的遗传学，对应地选用其化疗方案特定的抑制剂处理细胞。大多数模型中，循环耐药细胞相比非循环型都增强了脂肪酸代谢过程、抗氧化反应和NRF2特征基因（表达），表明作者的发现可以推广到肺癌以外的癌症类型中。

这些体外实验结果在基因工程小鼠模型上也得到了验证。这个小鼠肺癌组织中携带有一可诱导表达的突变型EGFR。经奥沙替尼处理后，相比没有接受药物处理的小鼠细胞，耐药细胞的ROS增多，脂肪酸代谢过程的特征基因表达增强。对于EGFR所致肺腺癌、BRAF突变型黑色素瘤（用BRAF和MEK酶的抑制剂处理）、HER2突变型乳腺癌（用拉帕替尼处理），作者对这三类肿瘤患者的样本细胞也做了化疗前后基因表达的变化评估。在上述情况下，相比未处理的肿瘤细胞，处理过的耐药细胞，其ROS产生过程和脂肪酸代谢过程的特征基因表达都增强了，且循环型耐药细胞表达上述特征基因多于非循环型。

Oren等人的研究符合当前工作重点的大背景，突出了非遗传机制在耐药细胞生存和增殖中的重要性[2-4]。研究耐药细胞时一个主要问题，是耐药细胞为原始的肿瘤细胞群中很小的一部分，因此难以通过群体细胞测序刻画其特点。作者的“西瓜”技术，价值就在于能以单细胞分辨率得到耐药细胞的详细特征。未来发展方向之一可能是把类似的单细胞技术应用到其他肿瘤上，研究其耐药性的非遗传机制，比如胰腺癌[5]、前列腺癌[6]等，类似的研究正在这些领域中蓬勃发展。

理解耐药细胞的动态过程，对于发展更有效的癌症化疗方法十分重要。之前的研究发现，在乳腺癌中发挥作用的雌激素应答通路[7]，以及铁凋亡这个细胞死亡相关通路[8,9]，跟耐药态密切相关。Oren等人发现，抑制这些通路虽然确实能降低耐药细胞数，但是会增加循环型耐药细胞比例，表明这些通路可能不是最佳的化疗靶点。

反之，他们发现用乙莫克舍（etomoxir）这种抑制剂，抑制脂肪酸氧化通路，能同时减少耐药细胞占比，并降低增殖型耐药细胞比例。这一有前景的结果显示，调整这一通路以及调控该通路中发挥作用的基因，或能开发新的治疗手段。

参考文献：

1. Oren, Y. et al. Nature 596, 576–582 (2021).

2. Salgia, R. & Kulkarni, P. Trends Cancer 4, 110–118 (2018).

3. Sharma, S. V. et al. Cell 141, 69–80 (2010).

4. Hata, A. N. et al. Nature Med. 22, 262–269 (2016).

5. Chen, P.-Y. et al. Cancer Res. 78, 985–1002 (2018).

6. Jolly, M. K., Kulkarni, P., Weninger, K., Orban, J. & Levine, H. Front. Oncol. 8, 50 (2018).

7. Garon, E. B. et al. J. Thorac. Oncol. 8, 270–278 (2013).

8. Angeli, J. P. F., Shah, R., Pratt, D. A. & Conrad, M. Trends Pharmacol. Sci. 38, 489–498 (2017).

9. Hangauer, M. J. et al. Nature 551, 247–250 (2017).

原文以A persistent look at how tumours evade therapy为标题发表在2021年8月11日《自然》的新闻与观点版块上

© nature

doi: 10.1038/d41586-021-02117-1

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