细菌、基因与土壤：病原体往事 | 《自然》技术特写
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原文作者：Amber Dance
在DNA测序仪和强力计算工具的支持下，考古遗传学家正将注意力转向古代微生物，将之置于人类史上应有的位置。
引发瘟疫的细菌现在可以往几个世纪以前追溯了。图片来源：Getty
首次有记载的梅毒疫情暴发于1495年法国军队入侵那不勒斯期间。从那里，这种性传播疾病很快传遍了欧洲——可它是从什么地方来的呢？
这次暴发的时间，以及其它证据让部分研究者推测，意大利探险家克里斯托弗·哥伦布的船员在跨大西洋航行时将致病菌梅毒螺旋体（Treponema pallidum）从美洲带了回来[1]。但瑞士巴塞尔大学的考古遗传学家Kerttu Majander说，来自古微生物基因组的新数据给该理论打上了问号。
Majander研究了来自欧洲的人类骨骼和牙齿样本——这些人下葬的年代接近于或晚于哥伦布远航的时间。她发现了两个梅毒病例：其中一例是被称作雅司病的相关疾病，另一例则是一种不再传播的相关细菌[2]。引发这些病变的都是梅毒螺旋体的亚种，而在来自荷兰、芬兰与爱沙尼亚（距离哥伦布停泊的地方都很远）的感染者骨骼上表现出的遗传多样性显示，这些微生物在欧洲流行的时间可能远早于1490年代。不论哥伦布一行做过别的什么，他们在将梅毒带回旧大陆一事上兴许是无辜的。
除了满足对历史的好奇，与人类共存的微生物生活史和人类自己的故事紧密交织，揭示两者之间的关系非常重要。“当下的大流行深刻表明，人类需要理解有关传染病如何经时兴起及演化的关键问题。”在澳大利亚多尔蒂研究所研究传染病演化的计算生物学家Sebastian Duchene说。
德国马克斯·普朗克演化人类学研究所的古DNA专家Kirsten Bos说，就在几十年前，从数百年历史的骸骨中重获可用于测序的DNA碎片，看起来还是不可能的任务。但是二代测序技术极为适合研究从古微生物基因组中获取的短链，有些长度仅有30个碱基对。
这些技术让研究人员得以将病原体与历史记录中仅有模糊描述的疾病对应起来，也可通过伴随人类活动和迁徙的微生物，追溯这些事件。Bos及其他研究者证实，鼠疫杆菌（Yersinia pestis）确实引发了十四至十八世纪第二次大流行[3]、始于六世纪的查士丁尼瘟疫[4]、乃至早于文字记录的鼠疫暴发。古基因组数据还显示，鼠疫杆菌甚至在有能力感染跳蚤（目前的传人模式）前，就已经能够传染人类了[5]。研究人员对数万年前的口腔微生物做了DNA测序[6]，如果有合适的样本，他们或许还能追溯到更久以前。
这样的工作需要仔细的样本制备、强大的计算工具、以及将真正的古基因组与现代污染物相区分的专业知识。此外，在科学家（多数来自富裕的北半球国家）公开发表有关世界其它地区古代人类的私密生物学细节之时，还会产生相应的伦理问题。与此同时，研究者持续推动技术前沿的发展，对人类与微生物相互交织的历史进行更深入的探索。
“所有病原体都有自己的故事。”英国弗朗西斯·克里克研究所的遗传学家Pooja Swali说。“我们只是在试着拼出全貌。”
快速发展的领域
要拼出古微生物的故事，第一步通常是研究骨骼遗骸。包括梅毒和麻风在内的几种疾病会在骨头上留下痕迹，对这些病原体感兴趣的科学家能够从豌豆大的样本里提取DNA。其它情况下，牙齿内腔也是个开展研究的好地方：血流直接滋养牙髓，而这个地方通常能在几个世纪里保存良好。对口腔菌群有兴趣的科学家或许会从一小块牙结石着手；还有保存下来的粪便，尽管罕见，却能提供关于肠道菌群的线索。美国哈佛大学的生物分子考古学家Christina Warinner称，甚至古老的食物容器也可能藏有能提供饮食相关线索的微生物。
不论来源为何，与现代微生物基因组学所用的样本相比，古微生物样本都可谓是“饱经风霜”。骨骼和牙齿往往在土壤、地下墓室或博物馆里度过了几代人的时间。水和热会破坏DNA，所以越冷越干燥的环境就越有利。即便如此，随着时间的推移，环境中的微生物还是可以渗入到骨头里。在考古学家经手遗骸、或在遗骸被储藏到博物馆的时候，现代微生物也会附着上去。
牙结石可将微生物DNA保存数千年。图片来源：Werner Siemens Foundation, Felix Wey
为避免样本制备过程中出现任何新的污染，古DNA研究者在超净间工作，并且使用所能获得的最干净的试剂。他们的实验室非常类似那些用于研究传染力极强病原体（如黄热病和肺结核）的实验室，但这里保护的是样本，而不是科学家。“我们开玩笑说，我们做清洁多过搞科研。”美国宾夕法尼亚州立大学的古微生物学家Laura Weyrich说。
序列比对
对样本进行整体测序的结果是得到一个宏基因组：即来自多种生物体的遗传密码片段，这包括人类宿主、研究者想要的微生物，以及微生物污染物。德国图宾根大学的考古基因组学家Maria Spyrou说，里面也许会有1%是科学家希望获得的微生物DNA，如果他们是在寻找某个特定的病原体，那么数量将会更少。不过，一旦研究人员确定样本感染了某种细菌，他们就能用该生物体基因组小部分的片段作饵，“钓”出更多它的遗传物质。
奥地利维也纳大学的古基因组学家Meriam Guellil说，古微生物遗传学家对付的是珍稀之物：有时他们手中的素材只够进行一次基因组测序。在这样的情况下出错的可能性很高，这也是为什么现代全基因组测序需要覆盖30倍或更高。鉴于古基因组的覆盖度如此之低，“我们在诠释研究结果时必须慎之又慎。”Duchene说。
一旦研究者手头有了序列，他们就可以尝试将其与已知微生物的序列进行比对。一种较流行的方法是使用名为MALT的软件[7]，但由于它在计算上耗时甚巨，很多从业人员开始采用像Kraken那样更快的算法[8]。该程序将基因组和样本切成长度为k的小片段（称为k-mer，长约30个碱基），并在两者间寻找匹配。
MALT与Kraken都假设古代样本包含的物种存在于现代基因组库里，但这是一个大胆的假设：根据一项估算，只有约2%的细菌和其它原核生物的基因组被测过序[9]。
另一个办法是跳过比对这一步，将DNA碎片从头组装成基因组。这需要很高的测序覆盖度，但Warinner说“它能让我们发现还未被描述过的物种和基因。”例如Warinner与合作者在2023年的一篇报告中称，他们通过最早十万年前的尼安德特人和智人的牙结石重建了459种细菌的基因组[6]。
由于大量误导性因素的存在，这类分析很需要细心以及专业知识。比如，结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，结核病的致病菌）就很容易和它在土壤中的某种无害近亲搞混，而骨骼又经常出现在土壤里。去伪存真的一个关键是，古代基因组应当受损严重，但现代污染物通常因其保存异常完好而引人注目。这是因为DNA在几个世纪的时间里慢慢破碎，致使单链游离在DNA片段的任意一端。裸露的胞嘧啶碱基经常会失去上面的氨基，而胞嘧啶则会转化为尿嘧啶（这通常不存在于DNA中）。在对数据进行测序时，尿嘧啶会以其对应的DNA碱基胸腺嘧啶的形式出现在片段的某一端。一种叫做mapDamage的计算工具能够帮助研究者追踪这些模式。
来自古代的牙齿及其中的微生物正帮助我们了解祖先的历史。图片来源：Werner Siemens Foundation, Felix Wey
古基因组专家建立了一个互助社区，热情帮助那些缺乏此类细致专业知识的人。他们称该社区为“古宏基因组学的标准、预防措施及进展（SPAAM）”。Swali介绍说，例如，SPAAM的Slack工作区里有一个频道叫“尽管发问（No Stupid Questions）”供那些有志学习的人使用。SPAAM另一个名为AncientMetagenomeDir的项目则通过所有相关标签（如数据库登记号和日期）对已发表的古基因组数据进行编目[10]。
更进一步
从事古DNA研究不单单意味着与其他分子生物学家合作，共事对象也包括博物馆工作人员、历史学家，乃至研究对象的现代亲属。Spyrou说，这些合作能在极大程度上推进研究。例如，在调查吉尔吉斯斯坦两处十四世纪墓地的鼠疫杆菌时，Spyrou与来自英国斯特灵大学的Philip Slavin（自称“往日科学家”）进行了合作。Slavin研究了墓碑上的墓志铭、发掘得到的十九世纪日记，以及当地社群与欧亚大陆其它地区的贸易往来。这些细节为他们2020年发表在《自然》上的遗传学内容增添了重要的背景材料[11]。
“这不仅仅是要研究这些病原体、或这些人的基因组。”Spyrou说。“更重要的是给出完整图景。”
这样的图景里，真实的人曾经生活、劳作、相爱过——并留下了后代。科学家有时急于发表他们的研究成果，却忘记了这一事实，墨西哥国立自治大学Juriquilla校区的古基因组学家María Ávila-Arcos告诫说。
Ávila-Arcos担忧，大量从事繁重、昂贵的古DNA分析的实验室都集中在富裕国家，但其中部分实验室研究的样本来自欠发达国家，这些实验室通过发表那些地方的历史叙事使自己得益[12]。“这有点像是在榨取——我在某些场合会用这个词——作为国家遗产一部分的古代样本，然后在‘工厂’对其进行处理，获取成百上千的古基因组，并发表相关论文，但对样本采集地的机构、科研人员或当地社区，没有产生任何实际的好处。”她说。
Ávila-Arcos还说，科学家应当与本地研究者合作（他们可能更理解本地文化），而不是迫不及待地自己采集样本。她还建议研究人员对他们得出的结论采用谨慎的措辞，以避免污名化特定族群。举例来说，她的团队曾研究过在如今墨西哥一带，在殖民时期流行病背后的病原体[13]。她发现的基因组与乙型肝炎病毒和人类细小病毒B19的毒株有关，研究团队发现这些病毒很可能是因为跨大西洋奴隶贸易从非洲引入墨西哥的。在论文里，她谨慎地强调了其中的关联在于奴隶贸易，而非暗示流行病能怪罪于遭到奴役的个体。
Weyrich则说，在研究年代更近的遗骸时，亲属或后裔可能会担心哪些结果应当被发表。比方说，如果样本含有性传播疾病的证据，后代也许会忧虑这一事实一旦公之于众，他们的家族会遭到抹黑。她认为，在采集样本前以及获得结果后，与当地人及其代表进行协商都很重要。例如，在一项涉及分析来自法属波利尼西亚的牙结石的项目中，Weyrich一直与当地的文化和遗产部、塔西提及群岛博物馆等机构合作，以确定共同的目标和存在的风险、了解当地人所希望的研究结果发表方式，并分享早期成果。
Warinner认为，科研伦理的另一要素是考虑发布原始数据。该做法的重要之处在于，它意味着科学家能从实验室分析的每一份牙齿或骨骼样本中获取尽可能多的信息，从而不浪费任何古代材料。比如，对古人类基因组感兴趣的科学家可能并不想保留微生物基因的相关数据，但这些数据在其他研究者那里或许派得上用场。拿一项研究青铜时代人类种群的原始测序数据来说[14]，它后来被用于发现了七例鼠疫，这将我们所知的人类与鼠疫杆菌的关系追溯到了至少5000年前[5]。
随着科学家继续突破技术层面的界限，这些伦理方面的考虑就会显得愈发重要。例如，研究者正在DNA病毒（如乙肝病毒[15]和天花病毒[16]）研究上取得进展，此类病毒的基因组比细菌的小得多。基因组脆弱的RNA病毒还要更难，但科研人员已经从一个多世纪前保存下来的、带有流感[17]和麻疹[18]病毒的肺部样本中成功提取了RNA。
研究人员甚至还开始用古代序列重建古蛋白质。Warinner团队用他们测序得到的旧石器时代微生物基因构建了两种蛋白质，它们生成此前未知的代谢物，被团队命名为古呋喃[6]。据他们推测，这些分子可能参与调节细菌光合作用。
Bos说，每当她认为古DNA研究者已经钻研到了分子保存所设的历史极限，就会出现一篇新论文证明她错了。“我不想再设定什么严格的界限说，我们能追溯到多久以前。”她现在说，“就那些留存下来的古代分子，我们不断地检验着实际能获取到的极限。”
每个信息片段都有用武之地。比方说，Majander很想进一步了解梅毒及其相关病原体在近代早期的传播。十八世纪以来，医生将梅毒归为“毁于原罪”城市中心的疾病——真是如此吗？Majander认为，妊娠期间的母婴传播还能够提供线索，揭示过去的家庭结构以及女性地位。尽管目前可供研究的、来自过去的梅毒基因组还屈指可数，但更多的序列也许可以判明病原体传播及影响人类生活的方式。
说到底，微生物并不是单独存在的，它们的历史经常反映了人类的历史。Majander和其他科学家正在一个基因组接一个基因组地揭开它的面纱。
参考文献：
1.Rothschild, B. M. Clin. Infect. Dis. 40, 1454–1463 (2005).
2.Majander, K. et al. Curr. Biol. 30, 3788–3803 (2020).
3.Spyrou, M. A. et al. Nature Commun. 10, 4470 (2019).
4.Wagner, D. M. et al. Lancet Infect. Dis. 14, 319–326 (2014).
5.Rasmussen, S. et al. Cell 163, 571–582 (2015).
6.Klapper, M. et al. Science 380, 619–624 (2023).
7.Herbig, A. et al. Preprint at biorXiv https://doi.org/10.1101/050559v1 (2016).
8.Wood, D. E. & Salzbert, S. L. Genome Biol. 15, R46 (2014).
9.Zhang, Z., Wang, J., Wang, J., Wang, J. & Li, Y. Microbiome 8, 134 (2020).
10.Fellows Yates, J. A. et al. Sci. Data 8, 31 (2021).
11.Spyrou, M. A. et al. Nature 606, 718–724 (2022).
12.vila Arcos, M. C., de la Fuente Castro, C., Nieves-Colón, M. A. & Raghavan, M. Front. Genet. 13, 880170 (2022).
13.Guzmán-Solís, A. A. et al. eLife 10, e68612 (2021).
14.Allentoft, M. E. et al. Nature 522, 167–172 (2015).
15.Mühlemann, B. et al. Nature 557, 418–423 (2018).
16.Duggan, A. T. et al. Curr. Biol. 26, 3407–3412 (2016).
17.Patrono, L. V. et al. Nature Commun. 13, 2314 (2022).
18.Düx, A. et al. Science 368, 1367–1370 (2020).
原文以Germs, genes and soil: tales of pathogens past标题发表在2023年7月12日《自然》的技术特写板块上
© nature
doi:10.1038/d41586-023-02154-y
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