【兽医化验室】涂片多种染色方法该如何选择？
兽医临床实验室常用的染色方法包括罗曼诺夫斯基染色（瑞氏染色、瑞氏-吉姆萨染色和Diff-Quik染色）、网织红细胞染色等，这些染色可以清楚地鉴别细胞和异常细胞的特征，适用于血像分析中所有细胞和其他脱落细胞的形态学分析。
一、罗曼诺夫斯基染色
罗曼诺夫斯基染色的染色液是由伊红（酸性染料）和亚甲基蓝（碱性染料）组成，伊红使碱性物质染成红色，亚甲基蓝使酸性物质染成蓝色或紫色。染色结果与染料的pH值，冲洗染片所用的水及细胞的类型相关:低pH、染色时间不足或过度冲洗均会导致血涂片过度粉染；高pH、过度染色或冲洗不足均会导致血涂片过度蓝染（图1、2）。
图1 一只健康猫的血涂片（瑞氏-吉姆萨染色），采用蒸馏水冲洗
图2 一只健康猫的血涂片（瑞氏-吉姆萨染色），采用自来水冲洗（pH值不合适）
1、瑞氏染色
瑞氏染色是一种组织细胞学染色法，是由伊红和亚甲基蓝染料混合形成的染液，主要用于染色外周血涂片和骨髓细胞，便于显微镜下观察和鉴别细胞类型。因为该方法能鉴别区分血细胞，因此常用于白细胞的分类计数。该方法染色时间短，对细胞质和中性颗粒染色的效果好，适于一般的临床检验。
图3 犬血涂片（瑞氏染色），嗜中性粒细胞
2、瑞氏-吉姆萨染色
瑞氏-吉姆萨染色效果综合了瑞氏染色和吉姆萨染色的优点，更适用于临床检验。但是该染液变性快、容易被污染，因此这类染色容易在血涂片中看到染色沉淀，注意与微生物、血液寄生虫等鉴别和区分。
3、Diff-Quik染色
Diff-Quik染色与瑞氏染色相同，均利用罗曼诺夫斯基染色技术原理改良而成，染色结果与瑞氏染色相似，但该方法染色时间短，约1分钟即可完成染色，且染色背景清晰无沉淀，因此常用于细胞的快速染色。这种染色和以上两种染色染色的平面滴加染色不太一样，属于浸没式的染色，而且在切换染液的时候不需要额外冲洗，直接换入下一个染液当中就可以了。
Diff-Quik染色存在局限性是对嗜碱性粒细胞不着色，或对肥大细胞颗粒着色效果不好。但是这种染色方法对犬瘟热包涵体的染色效果优于瑞氏染色和瑞氏-吉姆萨染色。
图4 A 犬瘟热包涵体（瑞氏-吉姆萨染色）B犬瘟热包涵体（Diff-Quik染色）
二、网织红细胞染色
网织红细胞染色液的主要成分是新亚甲蓝，主要用于网织红细胞活体染色，不仅可以鉴别点状和聚集状网织红细胞，还可诊断确认海因茨小体，因此常用于贫血病例的染色需要。网织红细胞是晚幼红细胞到完全成熟的红细胞之间的过渡性细胞，由于红细胞胞浆中存在嗜碱性的RNA物质，用网织红细胞染色进行活体染色后，镜检胞浆中可见浅蓝或深蓝色的网状结构。
网织红细胞染色的结果背景颜色明亮、清晰，而且不受染色时间过长的影响，反而染色时间越长，背景越明亮。
图5 猫点状和聚集状网织红细胞（网织红细胞染色） 海因茨小体（网织红细胞染色）
总结1：兽医临床细胞常用染色方法的特点与临床应用
染色方法 | 特点 | 临床应用 |
瑞氏染色 | 染色时间短，对细胞质和中性颗粒染色的效果好 | 血液（外周血和骨髓）：红细胞、白细胞分类、血小板、红细胞包含物、白细胞包含物；前髓细胞、早、中、晚幼红细胞、网织红细胞；早、中、晚幼粒细胞等 尿液、皮肤、粪便、鼻腔、阴道分泌物等：脱落的上皮细胞、白细胞、红细胞、微生物等 细胞穿刺：脱落的各类细胞、红细胞、白细胞、微生物等 |
瑞氏-吉姆萨染色 | 对细胞质和细胞核的染色效果好 易被污染，容易产生染料沉淀 | |
Diff-Quik染色 | 染色时间短，不易产生染料沉淀 对肥大细胞颗粒和嗜碱性粒细胞染色效果较差 | |
网织红细胞染色 | 染色背景颜色明亮、清晰，不受染色时间过长的影响 | 网织红细胞和海因茨小体染色 非再生和再生性贫血的鉴别诊断等 |
所有染色方法都有自己的优缺点，罗曼诺夫斯基染色在临床应用最为常见，不仅可以染色血液细胞和其他器官细胞样本，也可以染色微生物，因此兽医临床普遍选用这几种方法进行细胞和微生物染色。商品化的瑞氏-吉姆萨染色成本相对较低，因此很多医院选择采用这种染色方法，但是就染片的质量来讲， Diff-Quik染色为最优选择，不仅因为染色时间短，而且染料沉淀的干扰小。在使用这些染色方法的过程中，需要注意的几点事项：
1、 染液中含有甲醇，易挥发，因此染色结束后及时盖上染液缸，防止染液挥发；
2、 显微镜下观察染色结果，发现染片有过多杂质时需要及时更换染液；
3、 怀疑有微生物的细胞涂片，不建议涂片放入染缸中染色，避免微生物污染染液，可以采取在外滴染的方式进行染色。
总结2：染色异常的原因和解决办法
染色异常 | 原因 | 解决办法 |
染色剂偏酸（红色） 红细胞呈明亮的橙红色 白细胞细胞核呈淡蓝色 嗜酸性粒细胞颗粒呈明亮的橙红色 | 缓冲液或染料酸性太强 缓冲液过多 染色时间不足 涂片非常薄 久置染料（乙醇被氧化） | 纠正pH，重制缓冲液 减少缓冲液时间或量 延长染色时间 纠正涂片厚度 检查染料的有效期限 |
染色剂偏碱（蓝色） 红细胞呈蓝绿色 白细胞细胞核呈蓝紫色 嗜酸性粒细胞颗粒呈灰色或蓝色 嗜中性粒细胞细胞质呈黑色 淋巴细胞细胞质呈灰色 | 缓冲液或染料碱性太强 缓冲液不够 染色时间过长 涂片太厚 | 纠正pH，重制缓冲液 延长缓冲液的时间和增加缓冲液的量 降低染色时间 纠正涂片厚度 |
染色杂质多 | 染料沉淀 冲洗不足 | 过滤或更换染液 检查清洗时间 |
本文来自：元亨宠物
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