CAR就绪，奇幻旅程才刚刚开始 | 汉清评癌

撰文 | 杜汉忠博士

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撰文 | 张清

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翻译编辑 | 胡小洁

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2017年的8月30日让世人看到了癌症战役的曙光。这一天，美国FDA审批通过诺华的嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法Kymriah（通用名tisagenlecleucel），用于治疗儿童和25岁以下人群的复发B-细胞急性淋巴细胞白血病（ALL）。这一刻在很多方面具有历史意义。CAR-T细胞疗法成为美国首个批准用于疾病治疗的基因疗法。

这个决定，并不是基于常规要求的随机性III期临床试验，而是基于II期单臂临床试验所获得的积极结果，即在难治的B细胞急性白血病患者中获得的完全缓释率高达80%。按照一次注射花费47.5万美元的价格，这一基于患者自身白细胞的独特的T细胞疗法成为迄今为止最昂贵的癌症治疗手段。但最为重要的是，许多血液学家和肿瘤学家自己都没有想到，在经历了传统治疗方式的失败之后，急性B细胞白血病领域会出现这么多的治愈病例，而这只需一次小小的注射，将患者自己的T细胞经过基因改造后再次注入体内。在这场具有里程碑意义的临床试验中，过半数的B-ALL患者经历了同种异体（来自捐赠者）造血干细胞移植，而另外许多患侵袭性B-ALL的患者不适合进行造血干细胞移植，且前期已经受过多次化疗。基本上没人想到会成功。

一路走来

追溯到CAR的起源和雏形。早在1980中期，以色列免疫学家齐利格﹒伊萨哈（Zelig Eshlar）在帕罗奥图（Palo alto）做他的sabbatical研究，主要方向就是，如何诱导T细胞来消灭不同的靶点。这就要求T细胞首先要识别一些特定的分子。他认为，通过导入外源DNA能够有效实现这个功能。之后他回到以色列继续这个探索。多次失败后在1980末期看到了希望，他将一些基因片段的组合导入一种永生细胞。这类细胞更容易接受外源DNA，产生识别新靶点的力量。迈出了第一步。之后，就是如何识别新的蛋白靶点，如何减少T细胞攻击正常细胞等。斯隆-凯特琳癌症纪念医院（MSKCC）的米歇尔·萨德莱恩教授（Michel Sadelain）把基因引入人的T细胞，花了3/4年时间才成功导入到0.5%的细胞中。

同时，卡尔﹒朱恩教授（Carl June）在贝塞斯达开始深入到HIV的研究领域中，并由此研究透了T细胞的很多特性，他大概花了10年时间，训练T细胞如何在HIV病人体内繁衍，什么信号能够激活T细胞等。1995年，朱恩教授遭遇了妻子被诊断卵巢癌的打击，他深切感受到肿瘤带来的痛苦，并下决心，要用手里的武器转而针对肿瘤治疗。他的妻子在2001年去世，这个不幸遭遇，不仅对朱恩的家庭是一个巨大的转折点，在人类历史的肿瘤免疫肿瘤方面也留下重重一记。

朱恩在肿瘤治疗方面的决心得到了戴维﹒波特（David Porter）以及斯蒂芬﹒戈鲁普（Stephan Grupp）的大力支持。各路英雄汇聚一堂，加上萨德莱恩, 罗森伯格（Roserberg）, 马尔科姆﹒布伦纳，大家认为，CD19有可能成为一个极好的治疗靶点。

接踵而至的第二个问题就是，如何优化CAR的设计来靶向CD19。萨德莱恩，罗森伯格等找到了CD28。朱恩选择的是4-1BB，因为他发现4-1BB能够促进T细胞繁衍。圣犹达儿童医院（孟菲斯）的达里奥﹒坎帕纳医生，用4-1BB设计了第一个CAR。和其他人不同，朱恩使用了灭活的HIV病毒来改造T细胞。宾西法尼亚大学用4-1BB CAR治疗了3例白血病患者，这是一个里程碑。竞争是激烈的，也有很多官司在几大学术机构进行。其中细节不赘述。

拓展阅读：宾大June教授团队成功要素详解

寻找更优CAR

我第一次接触到死亡是在14岁，我的一位同学得了急性白血病。我们去医院看望过他几次，当时几轮化疗下来，癌细胞变得越来越“狡猾”，而且对进一步的化疗产生了抵抗力。信仰治疗者也来过了，信誓旦旦能让他活下来，但最后什么也没有发生，不到一年时间他就去世了。我们都感受到强烈的无助和失落感。

上世纪80年代，当我还是英国伦敦皇家自由医院医学院的学生时，并不知道本校的两位著名讲师马尔科姆﹒布伦纳博士和达里奥﹒坎帕纳博士正尝试着向T细胞内注入基因，以开创这一癌症治疗的最先进方法，同时研究急性白血病生物学。

那时，手术、化疗、激素和放射治疗是对抗癌症的武器。同一时期，齐利格﹒伊萨哈博士则回到了以色列，他在美国帕罗奥图市休公休假期间得到了极大的启发，决定开始创造能够潜入血液中探测并攻击癌细胞靶点的T细胞。那时早期的研究，更像是一部科幻小说，而且失败是家常便饭。争议不断。后来，坎帕纳博士在CAR-T细胞架构的抗体机理中置入了一个分子——4-1BB，将它作为超强探测“引擎”。有了它，CAR-T细胞可以更强健的扩张，在人体内停留更久，让T细胞更有效的杀灭癌细胞。总算是找到了！它就像一场梦！另一个超强探测“引擎”分子是CD28，它被用在其他的CAR-T细胞结构中。第三代CAR们的架构设计中则有了不止一个这样的“引擎”。这些经过基因改造的T细胞，借由一个没有激活的人类免疫缺陷病毒属病毒——慢病毒，将CAR置于内部，在人体内以上千倍的速度生长和扩张。但“开着CAR兜风”并不那么一帆风顺，因为像细胞激素释放症候群（CRS）和脑水肿这类副反应往往会置人于死地。

上世纪90年代后期，我在美国波士顿的麻省总医院做骨髓移植的主治医师，那时，骨髓移植如何攻击并杀死癌细胞这一理念上出现了戏剧化的转变。曾经，研究者们都认为，在骨髓细胞再次回到患者体内重新生长为患者骨髓前，用超高剂量的化疗或放射治疗（全身照射）来最大程度的杀灭癌细胞，是非常关键的一步；然而，实际情况越来越显示出，同种异体（并非来自患者自身）的骨髓细胞中本就含有有效的白细胞，其中主要就是T细胞，这些来自捐赠者的细胞能够发现、辨认和攻击癌细胞。这一发现让白血病和淋巴瘤的治疗有了最大程度的改观。策略上的根本性转变对于T细胞癌症治疗方法十分关键，这也体现在CAR注入前进行先期化疗这一原则上。大体上，氟达拉滨和环磷酰胺联用被当作了CAR-T细胞治疗前的先期化疗，以此让注入的T细胞在患者体内更有效的扩张，持久的打击癌细胞。

1999年，我在德州休斯顿的贝勒医学院细胞和基因治疗中心担任研究员，那时我才第一次见到布伦纳博士。从那以后，他便成为我的良师和益友。上世纪80年最后几年，我们可能都穿行于贝尔塞斯公园的伦敦地铁，前往皇家自由医院，却互不相识。而这次，布伦纳博士正在研究CAR-T细胞，并特别针对病毒驱动癌症，如EB病毒相关的癌症：移植后淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和鼻咽癌，设计能作用于多个靶点的T细胞。通过打击唯一靶点CD19，CAR-T细胞疗法对B细胞白血病和淋巴瘤的治疗战绩卓著，但这并不适用于实体瘤。CAR-T细胞疗法已尝试着打击20种以上的实体瘤蛋白，皆铩羽而归。

7年多以前，在B细胞白血病的治疗成功后，卡尔﹒朱恩教授和戴维﹒波特教授率先将CAR-T细胞疗法推向临床。其他团队同样在淋巴瘤和骨髓瘤的治疗上取得了显著进展。

现在，细胞免疫治疗的滚滚车轮已在朝着设计新的更好的CAR这一方向前进，其中一些可以进入维护癌细胞尤其是实体瘤的肿瘤微环境，在这片错综复杂的“原始丛林”中披荆斩棘。一些新CAR能够作用于不止一个癌症抗原，有一些独特的CAR在设计时采用了最前沿的基因编辑技术如CRISPR-Cas9。还有一些CAR中包含某些分子，能够对抗抑制性的肿瘤微环境。“现货版”同种异体CAR-T细胞节省了诱导免疫细胞分化的时间，目前这一方法正在接受测试。CAR同样被直接注入到患者的脑脊液中治疗脑癌，并取得了意想不到的初步成功。笔者最近在新加坡与达里奥﹒坎帕纳博士喝咖啡时，他聊到，目前他正尝试将全新的CAR置入到扩增的自然杀伤细胞（NK细胞）中，将其作为T细胞之后的新一代细胞治疗平台。

挑战在哪里

单一靶点的CAR-T目前研发相对成熟，同时多靶点的CAR-T工程细胞也在进行临床试验。目前中国已经有121项临床试验在clinicaltrials.gov上注册，主要分布在北京（30项）、上海（22项）、广东（20项）和重庆（15项）、江苏（13项）等地。

挑战仍然有不少，比如CAR的设计（不同的组合、不同代的CAR），生产的工艺流程，临床实验的设计和执行，不良反应的预测的控制，伴随着医生、患者两方面的教育和认识，都在不断发展。

目前，在CAR的设计中，大多数是含有一个共刺激信号的二代CAR（CD28和CD132），也有四代CAR（加入了基因编辑的成分，可带来细胞凋亡导致自我毁灭）。通常用慢病毒或者逆转录病毒载体将基因盒导入T细胞的基因组中。同时，对于肿瘤新抗原的探索也在进展，力图尽量减少脱靶效应带来的不良反应。目前最常见的是CD19，随后有CD20，CD123，CD138，BCMA等。针对实体瘤的靶点有GPC3，mesothelin，EGFR以及GD20（神经母细胞瘤）。

大多数CAR-T的临床试验都是自体细胞，也有更早期的一些尝试在off-the-shelf（异体细胞）的通用型细胞中。FDA在叫停Cellectis公司的UCART123试验之后的2个月，再次开了绿灯，继续试验，但加入了一些关键安全性衡量点，如剂量、患者招募的分期（时间间隔28天）、环磷酰胺的剂量控制、年龄不超过65岁等。在今年12月的ASH会议上，Cellectis将汇报更多SLAMF7（通用型）CAR-T细胞在多发性骨髓瘤方面的进展以及UCART22在B型ALL中的数据，UCART123的结果也被接受作为海报汇报。让我们拭目以待。

生产方面的挑战在成药方面至关重要。史蒂文﹒罗森伯格（NCI）教授，细胞治疗领域的前辈，在多年前就说过，对于制药公司来说，他们“不关心制成第一个药片是不是花了500美金，只要第二片能用1美金的成本做出来”。如果持续、稳定的处理获取的免疫细胞、产生CAR，如果是人工操作，那每一步都有可能引入人为误差。这要求我们建立一个严格、统一的生产流程，持续不断生产高质量的CAR-T细胞，要求安全、纯净以及有效。持续性（Consistency）在产品质量的评价当中有相当的分量。才能够预测每一个批次的细胞活力。

整个过程主要有几个变量需要控制：原材料（例如，患者自身的滤出白细胞leukapheresis），人源或动物源的试剂（如血清、抗体等），控制关键成分（载体，容器）。GMP的要求很多细节都需要理解并落实，也需要回顾历史上的经验，比如dendreon的案例等。从一开始，自体细胞就已经引入了极多变量：它的成分是多种的T细胞混合物，有细胞毒（效应T）细胞，助T细胞以及调节T细胞等。同时也分泌细胞因子、细胞毒性颗粒等。在B-细胞肿瘤中，细胞成分可能会因疾病阶段、个体的基因组型、年龄、感染状态和既往治疗史而不同。原料里是一个大杂烩，有T细胞、B细胞、单核细胞、粒细胞、NK细胞、红系细胞、树突细胞以及血小板等。这些亚分型可能会稀释关键的成分，影响T细胞的激活和生长，也可能对T细胞的激活、扩增、转导效率等有直接的负面影响。

鉴于最开始的细胞成分并不完全可控，可能需要想想，如何评估这些不同细胞组分的潜在风险，以及如何统一评价不同患者的差异性表现。

细胞治疗目前最主要的几个顾虑在于：如何管理CRS、其他神经毒性、潜在的长期致癌风险等。CRS通常出现在细胞输入后的1-14天，时间的长度取决于严重程度和干预方式。现已知的几个最相关因素包括IFN-gamma，IL-6，IL-2受体a以及IL-10。CRS和HLH（巨噬细胞激活综合征）有很多共性。干预手段基本上都是对症。陆续有报告一些成功的方法，比如抗IL-6治疗（Tocilizumab）和/或激素治疗。尤其是IL-6水平较高的患者，对Tocilizumab的反应更好。如何快速识别CRS也很重要。给临床医生设了一个极大的考题。相比之下，神经毒性总体来所更容易逆转。其他方面的数据相对较少，目前很难有明确的结论。比如，RCR（有复制能力的逆转录病毒）和载体导致的基因毒性。

到2025年，抗癌药市场规模将从现在的450亿美元增长至1000亿美元，其中免疫疗法将成为主要增长领域。个体化的T细胞治疗价格高昂，非普通人所能承受。当第二次世界大战期间盘尼西林首次被小批量生产出来时，它的价格也达到每磅70万美元。现在，人们买抗生素只需要10美元。让我们期待着有一天，T细胞免疫疗法的价格也会变得如此亲民。

而现在，还是让我们来庆祝这一激动人心的成就吧，以往极难治愈的晚期白血病和淋巴瘤患者，将会看到前所未有的治愈率——更多癌症也会如此。在未来的癌症治疗道路上，神奇的CAR之旅才刚刚开始。

汉清专栏

汉清专栏由来自肿瘤领域的两位医师主笔：新加坡国立癌症中心副院长杜汉忠博士和本草资本张清博士。

胡小洁

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