【临床研究】抑郁症患者外周血miRNA-219和钙调蛋白激酶Ⅱγ亚基mRNA表达水平的临床意义

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文章来源：中华精神科杂志,2019,52(2): 134-138

作者：余正和 李轶 李静 宋明芬 王晟东

摘要

目的

通过检测首次发病抑郁症患者外周血中miRNA-219和钙调蛋白激酶Ⅱγ亚基mRNA（γCaMKⅡ mRNA）表达水平，分析探讨其与抑郁症之间的关系。

方法

纳入符合DSM-5中抑郁发作诊断标准的41例抑郁症患者（抑郁组）和31名健康对照者（对照组），采用HAMD₁₇评估患者的抑郁症状严重程度，采集受试者空腹外周血样本，采用实时荧光定量PCR法检测外周血白细胞中miRNA-219表达水平和γCaMKⅡ mRNA表达水平，采用t检验进行组间比较；miRNA-219表达水平、γCaMKⅡ mRNA表达水平、HAMD₁₇评分两两之间相关性采用Pearson相关分析。

结果

抑郁组外周血白细胞miRNA-219表达水平低于对照组（0.91±0.21与1.80±0.24，t=2.753，P=0.007 5），γCaMKⅡ mRNA表达水平高于对照组（5.55±0.57与2.16±0.20，t=4.970，P<0.01），差异均有统计学意义。并且抑郁组外周血白细胞γCaMKⅡ mRNA表达水平与HAMD₁₇评分呈正相关（r=0.460，P=0.002 5）。

结论

抑郁症患者外周血miRNA-219表达水平降低，γCaMKⅡ mRNA表达水平升高，提示miRNA-219和γCaMKⅡ表达水平可能与抑郁症发病机制存在一定联系。

抑郁症是由多种因素引起的情感障碍性疾病，主要表现为心境低落、快感缺失、思维迟缓、意志活动减退、认知功能损害，严重者出现自杀观念或自杀行为，具有发病率高、致残率高等特点。众多研究表明，抑郁症缺乏典型的结构性神经病理学标志，而呈现特异性分子病理学改变^[1]。遗传/发育因素和环境因素相互作用导致的分子和细胞功能异常^[2]，以及相关脑区神经元受损^[3,4]是导致抑郁症的重要原因。2018年有研究者在Nature发文详细阐述了N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）在抑郁症病理过程中的作用机制，发现NMDA受体活性可以影响抑郁症的病程^[5,6]。miRNA-219是NMDA受体信号通路中的重要调节因子^[7]，且miRNA-219可以通过直接作用于NMDA受体信号通路中的钙调蛋白激酶Ⅱγ亚基（calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ γ subunit，γCaMKⅡ）影响其下游信号^[7]，调节神经元功能。已有文献报道miRNA-219在精神分裂症^[7]和阿尔茨海默病^[8]等神经精神疾病中的作用及其分子机制。我们观察了抑郁症患者外周血miRNA-219和γCaMKⅡ mRNA表达水平情况，探讨miRNA-219和γCaMKⅡ mRNA表达水平与抑郁症病程的相关性。

对象和方法

一、对象

抑郁组：为2017年3月至2018年5月杭州市第七人民医院精神科门诊治疗的首次发病抑郁症患者41例。抑郁组纳入标准：（1）符合DSM-5中抑郁发作诊断标准的首次发病抑郁症患者，未服用过抗抑郁药；（2）汉族；（3）年龄18~45岁；（4）HAMD₁7评分>17分；（5）本人知情并签署知情同意书。排除标准：（1）合并其他精神疾病；（2）合并心脑血管及其他躯体疾病；（3）孕妇和哺乳期妇女；（4）酗酒、吸烟史≥1年；（5）服用过抗精神病药以及精神活性物质或镇静药物。

对照组：为与患者组同期杭州市第七人民医院职工健康志愿者31名。对照组纳入标准：（1）年龄18~45岁的中国汉族；（2）HAMD₁₇评分≤7分；（3）本人知情并同意。排除标准：（1）心脑血管疾病及其他躯体疾病；（2）有精神障碍史；（3）孕妇及哺乳期妇女；（4）酗酒、吸烟量大（≥每天10支）、喝浓茶或咖啡依赖者；（5）服用过精神活性物质或镇静药物。

本研究经杭州市第七人民医院伦理委员会批准，患者或其家属知情并签署知情同意书。

二、方法

1．血液样本采集及处理：

受试者入组后采取其静脉血5 ml于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，4℃低温保存并于2 h内处理血液样本。血液处理：加入3倍体积的红细胞裂解液（天根生化科技有限公司，北京），混匀后室温静置5 min，采用离心机（Legend Micro17，Thermo Scienticf，德国），离心半径5 cm，10 000 r/min，离心5 min，去上清取沉淀（白细胞），加入Trizol试剂（Takara Biotechnology，大连）1 ml，混匀后于-80℃冰箱内保存，待后续提取总RNA。

2．miRNA-219和γCaMKⅡ mRNA水平测定：

利用Trizol试剂进行总RNA提取，采用逆转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit（Takara Biotechnology，大连）进行逆转录，其中γCaMKⅡ mRNA采用试剂盒自带的olig dT作引物，miRNA-219采用上海吉玛公司合成的引物套装。使用实时荧光定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Takara Biotechnology，大连）进行定量检测，其中γCaMKⅡ以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参，miRNA-219以U6 snRNA为内参，扩增引物见表1，仪器为ABI公司生产的StepOne Plus实时荧光定量PCR仪（Life Technology，新加坡）。

3．量表评估：

采用HAMD₁₇评定患者抑郁严重程度，总分>17分为可能有中重度抑郁症。评估由2位副主任医师完成。

4．统计学处理：

采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，计量资料经检验符合正态分布，采用±s表示，组间比较采用t检验；miRNA-219表达水平、γCaMKⅡ mRNA表达水平、HAMD₁₇评分两两之间相关性分析采用Pearson相关分析。P<0.05差异有统计学意义。

结果

一、2组一般资料分析

对照组共31名，其中男10名、女21名，年龄19~43（28.5±1.2）岁，受教育年限（13.7±0.6）年。抑郁组共41例，男17例，女24例，年龄19~45（29.9±1.2）岁，受教育年限（14.4±0.5）年。2组在性别组成（χ²=0.638，P=0.424）、年龄（t=0.816，P=0.418）和受教育年限（t=0.881，P=0.382）差异均无统计学意义。

二、2组外周血白细胞miRNA-219表达水平

抑郁组外周血白细胞miRNA-219表达水平低于对照组（0.91±0.21与1.80±0.24，t=2.753，P=0.0075）。miRNA-219表达水平与HAMD₁₇得分无相关性（r=-0.2355，P=0.1383），见图1。

图1 抑郁组（n=41）外周血白细胞miRNA-219表达水平与HAMD₁₇评分的相关分析

三、2组外周血白细胞γCaMKⅡ mRNA表达水平

抑郁组外周血白细胞γCaMKⅡ mRNA表达水平高于对照组（5.55±0.57与2.16±0.20，t=4.970，P<0.01）。抑郁组外周血白细胞γCaMKⅡ mRNA表达水平与HAMD₁₇得分呈正相关（r=0.4601，P=0.002 5），见图2；而miRNA-219表达水平与γCaMK Ⅱ mRNA表达水平无相关性（r=0.226 7，P=0.154 1），见图3。

图2 抑郁组（n=41）外周血白细胞γCaMKⅡ mRNA表达水平与HAMD₁₇评分的相关分析

图3 抑郁组（n=41）外周血白细胞miRNA-219表达水平与γCaMKⅡ mRNA表达水平的相关分析

讨论

CaMKⅡ是一类钙依赖性蛋白激酶，可以调控Ca²⁺或钙调蛋白（Calmodulin，CaM）依赖的蛋白磷酸化级联信号反应，调节下游的cAMP应答元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）等核转录因子，从而对多种基因的转录和表达进行调控，改变神经元兴奋性，在神经元突触可塑性和记忆认知中起重要作用^[9,10]。CaMKⅡ在脑组织尤其是海马中高度表达，与脑胶质瘤及精神分裂症等神经精神疾病密切相关。有研究显示CaMKⅡ在脑胶质瘤中表达异常^[11]，Kocerha等^[7]研究表明，精神分裂症中miRNA-219过表达导致的NMDA受体功能异常是由γCaMKⅡ所介导。较多的研究中阐述了CaMKⅡ在抑郁症病理过程中的作用^[12]，但是关于CaMKⅡ在抑郁症中的研究结果不尽相同，有研究显示抑郁症模型大鼠海马中CaMKⅡ蛋白表达低于对照组^[12]，而另有研究显示抑郁模型小鼠僵核（lateral habenula）中βCaMKⅡ表达高于对照组^[13]。氯胺酮是通过抑制CaMKⅡ活性和调节下游蛋白合成发挥抗抑郁作用^[14]。我们发现抑郁症患者外周血白细胞中γCaMKⅡ mRNA水平高于对照组，这可能与我们的研究中所针对的组织不同或者CaMKⅡ的亚型不同有关。我们的研究结果表明γCaMKⅡ也参与了抑郁症的病理过程，但是γCaMKⅡ改变是抑郁症发病的原因还是结果，以及其在抑郁症病理过程中的作用机制有待进一步通过细胞实验、动物实验证实。

miRNA作为抑郁症潜在的分子标记物^[15]，也是目前的研究热点。最近研究显示NMDA受体功能在抑郁症发病过程中有重要作用^[5]，而miRNA-219是NMDA受体信号的重要调节子^[7]，所以我们首先比较了抑郁症患者和健康受试者外周血白细胞中miRNA-219表达水平，结果显示抑郁症患者外周血白细胞miRNA-219表达水平显著低于对照组。另外有研究表明γCaMKⅡ是miRNA-219的直接作用靶蛋白之一，miRNA-219通过调节γCaMKⅡ影响神经元神经可塑性、神经认知^[7,8]和慢性炎性疼痛^[16]以及癫痫发作^[17]。有研究显示，在海马中miRNA-219通过调节CaMKⅡ调控砷引起的学习和记忆损伤^[18]。而我们的研究中并没有发现抑郁症患者外周血miRNA-219水平和γCaMK Ⅱ mRNA水平的相关性，可能原因为：（1）Kocerha等^[7]研究发现miRNA-219对γCaMKⅡ的调控是翻译后的调控，miRNA-219通过翻译后调控影响γCaMK Ⅱ蛋白表达水平，但未影响γCaMKⅡ mRNA表达水平的变化。（2）γCaMKⅡ并不是miRNA-219的唯一靶向蛋白，miRNA-219还有很多其他靶蛋白^[19]，可以通过这些靶蛋白来调节其下游信号。如miRNA-219可以通过调节表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）抑制神经胶质瘤细胞增殖^[20]，抑制致癌基因Sall4从而阻止结肠癌细胞增殖和侵袭^[21]，还可以通过转录后调节tau蛋白从而消除tau蛋白的神经毒性作用^[8]。我们的研究结果仅仅是观察到抑郁症患者外周血miRNA-219表达水平降低，γCaMKⅡ mRNA表达水平升高这一现象，然而要进一步证实这一现象，并阐明miRNA-219和γCaMKⅡ在抑郁症中的具体作用机制还需要进一步研究证实。如增加样本量进一步确证结果；通过尸检抑郁症患者相应脑区相关分子的表达水平，从而更准确的观察这些分子的变化情况；通过体外细胞实验以及在体动物实验进行相关的分子机制研究。

参考文献（略）

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