文章来源：中华精神科杂志, 2020,53(03) : 221-228
作者：胡晓蕊 沈宗霖 翟天柱 鲁毅 刘晓妍 程宇琪 许秀峰
摘要目的
探讨脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor, BDNF）基因多态性（Val66Met，rs6265）与首次发病未治疗抑郁症患者的大脑灰质体积的相关性。
方法
采用3.0 T磁共振成像对41例抑郁症患者（患者组）以及44名性别、年龄与患者组相匹配的健康对照者（对照组）进行头部磁共振成像扫描，同时检测受试者的BDNF基因rs6265多态性。采用基于体素的形态学方法（voxel-based morphometry, VBM）建立全因子分析模型，分析诊断（抑郁症与健康）和基因型（Val/Val与Met）对全脑灰质体积的影响。
结果
患者组与对照组rs6265基因位点多态性的基因型和等位基因频率差异均无统计学意义（χ2=0.004、0.048，均P>0.05）。诊断主效应脑区为左侧楔前叶（F=3.702，P<0.001）、右侧颞中回（F=4.020，P<0.001）、小脑蚓部_4_5(F=3.836，P<0.001)。BDNF基因型主效应脑区为左侧梭状回(F=-4.152，P<0.001)。诊断与基因交互效应脑区为左侧前扣带回(F=-4.775，P<0.001)及右侧前扣带回(F=-3.795，P<0.001)。进一步两两比较显示，在Val/Val纯合子携带者中，患者组较对照组左侧前扣带回(F=-3.729，P<0.001)灰质体积减小；在Met等位基因携带者中，患者组较对照组右侧枕下回(F=4.744，P<0.001)、左侧额中回(F=4.317，P<0.001)、右侧缘上回(F=3.838，P<0.001)、左侧中扣带回(F=4.041，P<0.001)灰质体积增大。
结论
BDNF rs6265位点等位基因与抑郁症相关脑区结构异常有关，可能参与了抑郁症的发病机制。
抑郁症常以持续的心境低落、思维迟缓、认知功能损害、意志活动减退和躯体症状为临床特征，这可能与抑郁症患者脑结构或功能受损有关，而遗传因素可能是影响因素之一[1]。抑郁症平均起病年龄为20~30岁，病程迁延，反复发作，复发率约35%，首次抑郁发作缓解后半数患者不再复发，但3次发作、未接受维持治疗的患者复发风险约100%。脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor, BDNF）表达水平的异常可影响神经元的发生，破坏神经元之间的联系，最终导致突触可塑性损伤。BDNF基因位于人类11p14染色体，该基因第196号核苷酸位点的碱基突变(鸟嘌呤➝腺嘌呤)使得BDNF前体蛋白第66号氨基酸由缬氨酸（Valine,Val）变为蛋氨酸（Methionine,Met），即BDNF基因多态性位点rs6265。BDNF的产生受rs6265基因位点突变影响，在分子水平上Met替换调节细胞内的信号传导，从而改变了BDNF的产生，同时也影响人海马功能和情景记忆[2]。携带Val基因型受试者脑中游离BDNF更多，抑郁症发病概率更低[3]。BDNF多态性是否与抑郁症发病有关仍是有待研究的问题，目前结构磁共振成像研究显示抑郁症大脑灰质体积变化与rs6265单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）相关性不一致。我们假设BDNF rs6265位点基因多态性可能与抑郁症患者的脑灰质结构异常有关，这种异常可能参与了抑郁症发病机制。因此，我们拟采用基于体素的形态学分析（voxel-based morphometry，VBM）方法，探讨BDNF基因单核苷酸多态性rs6265与首次发病未治疗抑郁症患者大脑灰质体积的相关性。
为2012年1月至2015年8月在昆明医科大学第一附属医院精神科门诊就诊的患者。所有入组患者均由2名精神科主治医师独立使用SCID-Ⅰ/P进行筛查。入组标准：（1）符合DSM-Ⅳ中抑郁症诊断标准；（2）首次发病，发病年龄<60岁，未经系统抗抑郁药治疗，并且未曾接受过改良电休克治疗、经颅刺激治疗或系统心理治疗者；（3）年龄18~60岁；（4）右利手。排除标准：（1）合并严重躯体疾病者，包括炎性疾病和自身免疫性疾病；（2）当前或既往患有神经系统疾病或有脑外伤病史者；（3）合并其他严重精神疾病或目前存在精神病性症状者；（4）有物质滥用史者；（5）孕妇和哺乳期妇女；（6）有磁共振成像检查禁忌证者。
为同期从社区和学校招募健康志愿者。入组标准：（1）年龄18~60岁；（2）右利手。排除标准：（1）有精神疾病家族史；（2）当前患精神障碍或既往精神障碍病史；（3）当前患严重躯体疾病和（或）神经系统疾病或既往有上述病史；（4）当前存在物质滥用或既往有物质滥用病史；（5）有脑部外伤史；（6）孕妇和哺乳期妇女；（7）有磁共振成像检查禁忌证者。本研究通过昆明医科大学第一附属医院伦理委员会的批准(2016伦审L第50号)，所有受试者均签署了知情同意书。磁共振成像扫描及图像采集工作均由昆明医科大学第一附属医院影像科磁共振室完成，图像采集使用荷兰飞利浦公司Philips Achieva 3.0 T磁共振成像仪，在标准头部线圈内完成扫描，头部放置海绵垫以减小患者头动。首先采用T1和T2加权扫描进行平扫以排除明显的结构异常。随后采用快速扰相梯度回波序列对每位受试者进行三维结构扫描。扫描参数为：重复时间=7.38 ms，回波时间=3.4 ms，层厚=1.2 mm，视野=250 mm×250 mm，矩阵=256×256，无间隔，翻转角=8°，层数=230层，扫描持续时间6 min 53 s。全脑数据均在轴向平行于前联合与后联合连线平行层面为基线进行采集。将所有受试者磁共振成像扫描原始数据DICOM图像导入影像数据工作站，采用MRIconvert软件将DICOM图像转换为NIfTI格式，在MATLAB2012a软件平台上将所有结构数据均使用脑统计参数图成像软件SPM8（Statistical Parametric Mapping，SPM8）中的VBM8工具包进行预处理，所有3D的影像学数据分析时均采用默认参数，将受试者的磁共振成像图像数据配准至蒙特利尔神经科学研究所（Montreal Neurological Institute，MNI）标准空间里的DARTEL模板上对数据进行标准化，然后将标准化的图像分割为灰质、白质和脑脊液，再对灰质、白质及脑脊液进行雅克函数校正，得到的灰质图像以8 mm的半高全宽进行平滑处理，运用SPM内置的标准模板制作灰质的mask，在此mask基础上将平滑后的灰质体积图像进行VBM比较。使用负压EDTA血液采集管采集所有受试者外周静脉血3~5 ml，轻摇混匀，每一血液样本取250 μl，采用血液基因组DNA微型制备试剂盒（AxygenTM Blood Genomic DNA Miniprep Kit，北京六合华大基因科技有限公司）提取所有受试者的外周血DNA，基因分型由北京六合华大基因科技有限公司完成。应用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术扩增目的DNA片段并进行基因分型。PCR扩增循环条件：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环反应35次，72℃延伸5 min置4℃保温。完成去盐后，经计算机分析程序，根据BDNF基因分型将患者组与对照组各分为Val/Val纯合子组、Met等位基因组。（1）一般资料统计：使用SPSS 22.0统计软件包对2组一般临床资料进行分析，计数资料（性别）组间比较采用卡方检验，计量资料（年龄、受教育年限）以描述，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。（2）哈温平衡计算：根据哈迪-温伯格（Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE）定律，对所有分型成功的SNP位点数进行χ²检验，P>0.05表示符合HWE平衡。使用SHEsis在线分析软件（http://analysis.bio-x.cn）计算哈温平衡[4]。（3）影像学数据统计：在SPM8软件中构建基因型×疾病诊断（抑郁症与健康）的全因子分析模型并进行两两比较，分析不同组间灰质体积差异，结果采用基于REST软件包中的AlphaSim程序进行多重比较校正[5]，以连续体素数k≥148，P<0.001为差异有统计学意义的脑区，校正结果对应校正后的P<0.05。
共纳入53例抑郁症患者，58名对照者。患者组rs6265分型成功率为94.3%（50/53），对照组rs6265分型成功率为96.6%（56/58）。所有受试者中拒绝采集影像资料者9人，3例患者和1名对照者磁共振成像数据采集信号不佳被剔除，5例患者和2名对照者3D磁共振成像数据分割失败被剔除。最终纳入基因、影像结果资料齐全者共85人，其中患者组41例，对照组44名。2组间年龄、受教育年限及性别差异均无统计学意义（P>0.05）；见表1。
患者组中Met等位基因携带者28例，Val/Val纯合子携带者13例。对照组中Met等位基因携带者30名，Val/Val纯合子携带者14名。携带Met等位基因者与携带Val/Val纯合子者性别、年龄、受教育年限差异均无统计学意义（P>0.05）；见表1。
BDNF的SNP位点rs6265的基因型分布在患者组（χ2=0.004，P=0.951）和对照组（χ2=0.048，P=0.827）均符合HWE平衡定律（P>0.05），样本具有代表性。三、BDNF基因rs6265位点多态性与抑郁症患者全脑灰质体积的关联分析1.诊断(患者组较对照组比较)对大脑灰质体积影响的主效应脑区为：左侧楔前叶、右侧颞中回、小脑蚓部_4_5；见图1和表2。
图1 磁共振成像示患者组（n=41）和对照组（n=44）脑灰质体积的诊断主效应和BDNF基因型主效应脑区
2.BDNF基因型(携带Met等位基因者与携带Val/Val纯合子者比较)对大脑灰质体积影响的主效应脑区为：3.BDNF基因型与诊断(患者组携带Val/Val纯合子者、携带Met等位基因者与对照组携带Val/Val纯合子者、携带Met等位基因者之间的比较)对大脑灰质体积影响的交互效应脑区为：双侧前扣带回；见图2。与对照组携带Val/Val纯合子者比较，患者组携带Val/Val纯合子者左侧前扣带回灰质体积减小；与对照组携带Met等位基因者比较，患者组携带Met等位基因者右侧枕下回、左侧额中回、右侧缘上回、左侧中扣带回灰质体积增大；见图3和表2。
图2 磁共振成像示患者组（n=41）和对照组（n=44）BDNF基因型与诊断交互效应脑区
图3 患者组Val/Val纯合子携带者（n=13）较对照组Val/Val纯合子携带者（n=14）以及患者组Met等位基因携带者（n=28）较对照组Met等位基因携带者（n=30）脑灰质体积差异脑区
我们采用结构影像学方法探索BDNF基因多态性与首次发病未治疗抑郁症患者大脑灰质体积的相关性，结果显示患者组中Val/Val纯合子携带者及Met等位基因携带者分别与对照组相比多个脑区灰质体积差异有统计学意义，提示与BDNF Val66Met多态性有关的大脑灰质体积变化可能发生在抑郁症的早期阶段。BDNF基因型与诊断对全脑灰质体积影响的交互效应表现为双侧前扣带回体积减小。在Val/Val纯合子携带者中，患者组较对照组左侧前扣带回灰质体积减小。前扣带回是内侧前额叶皮质的一部分，参与预期回报、决策、控制冲动和情感功能[6]。前扣带回和额中回是情绪处理的关键区域，前扣带回体积与重度抑郁症的病理机制和治疗反应有关[7]。抑郁状态下前扣带回皮质葡萄糖代谢活动增加，抗抑郁药治疗[8]和电休克治疗[9]可逆转前扣带回皮质的代谢增加。抑郁症患者尸体解剖研究显示，患者额叶眶区、前额叶背侧、前扣带回皮质厚度减低，神经细胞体积减小，神经胶质细胞丢失[10]。因此前扣带回对于抑郁症的发生及发展可能起至关重要的作用。此外，BDNF主要在海马、前扣带回和前额叶等抑郁相关脑区有较高的表达[11]。磁共振成像研究显示，前扣带皮质的BDNF浓度与N-乙酰天冬氨酸盐（神经完整性的标志）和胆碱（细胞膜流动性的标志）的浓度呈正相关，表明外周BDNF的浓度可能是潜在的脑皮质完整性的标志之一[12]。根据抑郁症的神经营养假说，压力可通过改变BDNF水平而导致脑结构异常，有研究显示，健康人中携带Met等位基因者较携带Val/Val纯合子者面对压力性事件时前扣带回灰质体积减少[13]。Tripp等[14]提出，抑郁症患者杏仁核中BDNF的表达减少和前扣带回皮质BDNF受体的表达减少。因此推测改变BDNF信号转导可能是一个复杂的上游事件（如压力因素、发展轨迹和遗传变异），该过程导致下游核心变化即减少树突抑制的标记，并且由众多因素如性别、脑区和大脑活动等进一步调节。综上所述，前扣带回灰质体积变化一方面提示了压力与BDNF之间重要的机制联系，另一方面提示压力与情绪障碍的机制联系。结合本研究结果提示，抑郁症前扣带回的体积变化可能与Val/Val纯合子携带者更为相关。Pezawas等[15]有关BDNF Val66Met多态性影响额中回灰质体积的研究显示，健康人Met等位基因携带者与Val/Val纯合子携带者相比，额中回灰质体积减少。最近有研究显示，健康人Met纯合子携带者与Val携带者相比额中回功能活动减少[16]。关于87名健康成人的VBM全脑分析表明，Met等位基因携带者与Val纯合子携带者相比，丘脑、梭状回和额中回体积减小[17]。与Val/Val组相比，健康成人Met/Met和Val/Met两组额中回、顶上小叶和楔前叶皮质明显变薄；通过VBM分析显示，Met纯合子携带者与Val等位基因携带者相比前扣带回、中扣带回灰质体积减少[18]。这提示健康人中Met等位基因与额中回减小有关。Legge等[19]研究发现，抑郁症患者Met等位基因携带者与Val/Val纯合子组相比额中回皮质厚度减少。虽然该研究结果与本研究结果并不一致，但至少可以明确的是Met等位基因携带者与额中回、中扣带回的异常有关，并且可能参与了抑郁症的病理过程。已有假设中提示，增大的灰质体积可能是细胞凋亡前渗透压变化所致的病理性体积增大，标志着早期的神经病理学改变[20]。因此，本研究显示在Met等位基因组中，抑郁症患者与对照者相比，右侧枕下回、左侧额中回、右侧缘上回、左侧中扣带回灰质体积增大，这可能与研究样本为首次发病、病程长短不一及未用药物治疗等有关。本研究显示，BDNF对脑灰质体积影响的主效应在左侧梭状回靠近左侧海马旁回。梭状回参与处理视觉空间信息。通过感兴趣脑区分析显示，健康人Met等位基因携带者与Val/Val纯合子携带者相比，海马旁回和右侧杏仁核体积减小；同时，全脑分析显示Met等位基因携带者与Val/Val纯合子携带者相比丘脑、梭状回和部分额叶减小[21]。研究表明BDNF Val66Met多态性的影响并不局限于海马，还可涉及海马旁回和杏仁核。有文献报道抑郁症患者梭状回灰质体积较健康人减小[22]，并且梭状回体积与负性认知正相关[23]。结合本研究结果提示，BDNF对大脑灰质体积影响的主效应在左侧梭状回，使情绪加工区域对负性情绪更加敏感，加重情绪障碍的发生。本研究显示抑郁症患者楔前叶灰质体积较对照组增大，该结果与既往研究结果并不一致。楔前叶与海马、丘脑有大量的神经联系，参与情景记忆的编码、提取。Fletcher等[24]研究发现楔前叶与情绪调节密切相关，且楔前叶是处理有意识记忆中视觉图像的重要神经基础。楔前叶位于顶叶内侧，而顶叶皮质与5-羟色胺受体结合能力有关，有学者发现顶叶损伤可造成皮质5-羟色胺受体功能下降，同时患者表现出抑郁状态［25］。另有研究显示抗抑郁药西酞普兰能改变抑郁症患者楔前叶局部葡萄糖代谢水平从而改善抑郁症状［26］，提示楔前叶损伤与抑郁症的发生有关。新近的结构影像学研究显示，轻度抑郁症年轻女性，左侧杏仁核和双侧后扣带回、楔前叶灰质体积增大[27]。Adler等[28]研究显示，双相情感障碍患者较健康对照者后扣带回和楔前叶灰质体积增大。国内有研究显示，双相情感障碍躁狂患者较健康对照者灰质体积增大的脑区包括左侧顶叶中央后回、双侧楔前叶、右侧额上回、左侧扣带回[29]。这些与前边缘网络系统有广泛联系的脑区体积增大提示可能由于神经元凋亡前水肿或神经元的肥大增生所致[30]。另外，从功能神经影像学研究分析提示，楔前叶参与了大脑默认模式网络[31]。Cavanna和Trimble［32］研究显示楔前叶与皮质结构存在广泛的网络连接。抑郁症患者较健康对照者左楔前叶局部一致性（regional homogeneity，ReHo）值显著升高[33]。关于首次发病未治疗抑郁症患者的研究显示，早发抑郁组较晚发抑郁组右侧楔前叶和双侧额上回ReHo值增加，ROC曲线分析显示，楔前叶平均ReHo值可作为区分早发性与晚发性抑郁症的生物标记[34]。以上提示楔前叶灰质体积增大可能反映了神经纤维连接异常，影响了楔前叶和默认模式网络其他脑区之间的神经传递。综上所述，本研究提示楔前叶灰质体积增大可能与抑郁症发病机制有关。越来越多的证据表明，小脑不仅与运动功能有关，还与其他皮质联合参与高级神经心理功能，提示小脑参与认知和精神疾病的病理生理学。蚓部位于小脑的中线，参与调节情感和认知过程[35]。有研究者通过VBM方法分析显示，抑郁症患者较健康对照者左侧小脑蚓部灰质体积增加[36]。有研究者分析重度抑郁症患者及健康对照者脑灰质体积变化的性别差异，发现男性患者出现左侧小脑灰质体积显著增加，双侧颞中回和左侧腹侧内侧额叶前回灰质体积显著减小[37]。关于147例首次发病未用药重度抑郁症患者与130名健康对照者的研究显示，早期发病组右侧梭状回、右侧颞中回、小脑蚓部灰质体积减小，晚期发病组左颞中回灰质体积增大[38]。35例未接受治疗以及35例既往接受治疗的抑郁症患者，分别与35名健康对照者比较的研究显示，长期抗抑郁治疗的男性患者小脑蚓部体积较大，未接受治疗患者小脑蚓部体积无明显变化[39]。因此我们推测，小脑蚓部体积增大可能是由于抑郁症患者额叶前部功能障碍所致连接异常或由代偿性反应引起，但这一假设还有待于进一步研究证实。本研究与以上研究结果不尽相同，提示抑郁症患者脑灰质体积改变并不一致，间接反映了抑郁症发病机制的复杂性。BDNF rs6265位点的遗传变异导致左侧梭状回，靠近左侧海马旁回灰质体积减小，而双侧前扣带回灰质体积减小是BDNF和抑郁症共同作用的结果，该结果提示BDNF Val66Met多态性可能在抑郁症发病机制中具有重要作用。本研究存在的局限性：首先，本研究经过样本量计算获得满意的统计效能，但对于群体遗传学研究而言总数不足100例的样本量研究结果仍有诸多局限性，因此还需要扩大样本量进一步研究。其次，由于Met纯合子数量的限制，我们将Met/Val基因型和Met纯合子合并计算，但由于抑郁症是一种复杂的多基因遗传疾病，仅关注于单个基因的单个位点进行研究，并不能较好地揭示该病遗传学机制的本质。第三，本研究为横断面研究，虽均为首次发病未服药抑郁症患者但患病时间长短不一，该因素可能会影响有关大脑结构的研究结果。未来可进一步扩大样本量，纳入具有不同临床特征的抑郁症患者，如复发性抑郁症、难治性抑郁症、早发性抑郁症或呈现慢性病程的抑郁症患者或进一步增加阶段性随访及不同治疗阶段之间的比较，以探索BDNF基因多态性是否与不同亚型的抑郁症具有不同的神经病理联系，明确是否BDNF rs6265位点的遗传变异可作为抑郁症发生发展的预测因子或某些特定类型抑郁症的易感因素。参考文献（略）