SBB/土传青枯病入侵破坏了根际细菌微生物组
题目：《Ralstonia solanacearum pathogen disrupts bacterial rhizosphere microbiome during an invasion》
土传青枯病入侵破坏了根际细菌微生物组
期刊：Soil Biology and Biochemistry (2018)
IF：4.9
通讯作者：徐阳春
摘要:植物病原菌入侵通常与物理环境条件的变化和寄主相关根际微生物群的组成有关。然而，目前尚不清楚这些因素如何相互作用相互关联并确定自然条件下的植物病害动态。为了研究这一点，我们在一个作物季节中对生长在中度侵蚀性的青枯病菌侵染下的番茄植株进行了时间取样。结果表明，土壤理化性质与病原菌侵染程度除水溶性氮浓度外均呈弱相关，而水溶性氮浓度在侵染过程中增加更为明显。而在病原入侵与（各种根际细菌类群的丰富度和多样性降低、细菌相互作用网络的简化和一些预测功能基因的丢失）之间发现了一个更为紧密的联系。温室试验中进一步证实了我们的结果，表明在受控的环境条件下，病原菌入侵导致根际微生物多样性和组成的相似变化。结果表明，番茄青枯病菌的入侵破坏了根际细菌群落，导致非致病菌的多样性和丰度明显降低。这些变化可能会潜在地影响在接下来的作物季节中继发性病原体入侵的可能性，因为多样性较低的微生物群落通常对入侵的抵抗力也较低。病原菌密度与非病原菌密度呈强负相关，进一步说明病原菌相对丰度比病原菌绝对丰度更能预测青枯病暴发的严重程度。因此，监测整个微生物群的动态可以为将来更精确的疾病诊断开辟新的途径。
背景与意义：青枯菌是一种革兰氏阴性植物病原菌，是全球青枯病流行的主因。它的寄主范围异常广泛，能够感染200多种植物，包括许多重要的经济作物（番茄、烟草、茄子等）。感染的第一步是植物根际定殖，病原体必须与其他细菌类群竞争。在达到阈值密度后，病原体会启动其毒力基因表达并入侵植物根部。一旦进入木质部导管，番茄茄青枯病菌迅速扩散到整个血管系统的空中植物部分。进而造成植物减产甚至死亡。了解植物病原菌在高度多变的田间条件下的感染是作物保护和未来粮食安全的关键挑战。进而弄清多种非生物和生物因素对病原体入侵的相对重要性仍然是了解疾病流行病学的一个关键挑战。
猜想：1.土壤理化性质和根际微生物群落组成是否与病原菌入侵的侵袭性相关。
2.病原菌入侵的侵袭性是否影响根际微生物群落的多样性和功能。
试验设计:
田间试验：无菌催芽→基质生长（30天）→移栽大田（10天后）→1-3周收集根际土（初始土壤）→4-12周收集（健康/发病）根际土
（注：在基质生长30天后，将30天龄的番茄幼苗移栽到连续被茄青枯菌侵染10多年
的大田，移栽后10天开始每周取样。在最初的三周里，由于没有发现明显的疾病症状，每周随机采集9种健康植物。从第四周开始，番茄植株开始出现萎蔫症状，随机采集6株健康植株和6株患病植株，12周采样结束。）
温室验证实验：无菌催芽→基质生长（至生长期）→移栽温室土（无发病史的健康土）→收集根际土（初始土壤）→根淋法接种（病原菌/灭菌悬液）→采样（病原菌接种20天后）根际土（健康/发病）6次，每次间隔两天
测量指标：
田间实验土壤理化：水溶性氮、水溶性碳、ph、铵、磷酸盐含量、硝酸盐含量
田间试验微生物：病原菌qPCR、细菌群落组成与多样性、基因功能预测
温室实验细菌群落结构与多样性
实验主要结果与讨论:
1.田间试验中蕃茄青枯病的发生与密度动态
图注：大田调查试验植物根际病原菌数量的动态变化：A不同分组植株根际病原菌数量随植物生长的动态变化；B不同分组植株根际病原菌绝对数量与相对数量的相关性。
蕃茄青枯病菌的绝对和相对密度正相关，特别是在患病样本fliC基因拷贝数达到108-108.5的阈值水平后。由B图可知病原菌入侵后发病植株根际微生物中病原菌相对含量显著上升，说明相对密度更能预测番茄发病严重程度。
2. 田间试验土壤理化变化。
图注：田间试验中土壤理化性质的差异。a-f组：初始（I，红色）、健康（H，绿色）和患病（D，蓝色）植物根际样品之间平均理化土壤性质的差异（随时间平均）。WSC表示水溶性碳，WSN表示水溶性氮，AP表示有效磷酸盐，NO3-表示硝酸盐，NH4+表示铵。小写字母表示p<0.05水平的统计差异。
在六种土壤理化性质中，只有磷的有效性在作物季节表现出不显著的变化（P=0.051，图2和图S3）。相比之下，水溶性氮（P<0.001）和硝酸盐（P=0.005）的含量增加，而水溶性碳（P<0.001）、pH（P<0.001）和铵（P<0.001）的浓度在作物生长季节下降。这表明植物发育（时间）对土壤理化性质的动态变化有明显的影响。然而，土壤理化性质与病样中的病原菌密度均无显著相关（P>0.12），只有pH值与健康样中的病原菌密度显著相关（这些数据与材料在补充材料中，由于理化性质与时间关联，与病原菌密度关联不大，就不再往上放）。
在所有测定的理化性质中，病株样品中只有水溶性氮含量略高，其他变量均无差异。无论pH值和有效碳降低与否，病菌密度都会随着时间增加。硝酸盐的有效性对番茄植物根和木质部附着和定殖过程中的茄青枯病菌毒力基因表达很重要，因此可能会影响病原菌的毒力，而不会对病原菌密度产生相当大的影响。总的来说，水溶性氮的浓度是与病害动态呈正相关的唯一理化性质。
3.田间试验中根际细菌群落组成及多样性的变化
图注：田间试验期间根际微生物组成和多样性的变化。a组：时间（植物发育）和病原菌密度变化对根际微生物组成的影响。b组：初始、健康和病态植物根际样品中细菌群落丰富度（OTU数）的差异。c组：与蕃茄青枯菌密度呈显著正相关或负相关的细菌OTUs百分率（P<0.05）。d组：初始、健康和病态植物根际样品（OTU数）的相对细菌密度动态（黑色的R.solanacearum和其他不同颜色的细菌门）。e组：初始和健康植物根际样品（H vs.I）、初始和患病植物根际样品（D vs.I）和健康和患病植物根际样品（D vs.H；*、**和***）的细菌种类丰度比较，分别在P<0.05、P<0.01和P<0.001水平上有显著性差异；向下和向上箭头分别表示第一组相对于第二组的细菌丰度的减少和增加。
在试验结束时，病态土壤中非致病根际细菌的相对丰度明显降低。放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、蓝藻门、绿湾菌门、假单胞菌门、疣杆菌门的相对丰度明显下降，其中放线菌产抗生素可能对病原菌其抑制作用，拟杆菌门的数量明显减少，尤其是来自噬几丁质菌属和芽孢杆菌属的物种，这些物种也因其对青枯病菌的拮抗活性（脂肽抗生素）而闻名。噬几丁质菌属与具有高β-葡萄糖苷酶活性的土壤群落有关，这表明细菌有能力分解纤维素可以通过增加死亡植物生物量中的有效养分数量来促进细菌多样性。
4.田间试验中非生物因素与生物因素对病原菌密度动态的相对重要性比较
图注：方差分析的分区解释了病原菌总密度变化与土壤理化性质、时间（植物发育）、根际细菌群落组成（家族水平）和多样性（OTU水平Shannon多样性指数）变化的相关性
根际细菌群落组成的变化解释了20%，土壤理化性质只有1%，植物发育（时间）占病原菌密度动态变化总量的13%。细菌群落组成的变化与土壤理化性质的相关性较弱，植物发育对总变异的解释不到1%，而植物发育与土壤理化性质的交互作用解释了病原菌密度动态总变异的36%。这说明土壤理化性质随植物生长发育呈明显的时间变化规律，与发病率和病原菌密度无明显相关性。无论土壤理化性质如何，蕃茄青枯病菌的入侵都会导致根际微生物组分变化。
5.田间试验中根际细菌共生网络变化的比较
图注：初生、健康和病态植物根际细菌共生网络特性的比较。初始根际、健康根际和病态根际样品网络性质的差异。
初始与健康植物网络具有高指数值，相比之下，患病植物网络的节点数具有较差的拟合度。对于顶部枢纽，属于α-变形菌的节点被一致地预测为跨越所有网络的正连接枢纽。虽然在初始网络中，酸杆菌的负连接数最高，但在健康和患病的植物网络中，放线杆菌和α-蛋白细菌的负连接数分别最高（图5）。这些数据表明，与患病植物样本相比，最初的细菌共生网络更类似于健康植物。结果表明，在致病根际样品中，病原体侵入与细菌共生子网络的数量和复杂性相关。表明，多样性的丧失与微生物群功能的丧失相关，可能导致与病原体抑制相关的功能丧失。一个可能的解释可能是，资源竞争加剧有利于病原菌的生长，而产生抗生素的细菌却要付出代价。
6.田间试验中病原菌侵染与功能基因丰度的相关性
几乎所有功能基因类别的COG模块（一组编码类似或相同功能的蛋白质基因）主要在病根际样本组中发生变化。在健康的根际样品中，只有很少的基因功能与病原体密度相关。推测的功能基因丰度与病根际的病原菌密度呈负相关。病原菌入侵与细菌胁迫相关基因的高表达联系起来，这些基因可能通过改变植物根系分泌物直接或间接导致微生物组分的变化。（现今通过16srRNA测序预测并不能很好的解释其中的机理，利用宏基因组测序更能直接深入的解释功能基因的变化）
7. 温室试验微生物组成验证
图注：温室分离试验中病原菌的存在和时间（植物发育）对根际微生物组成和多样性的影响。a组：番茄根际相对病原菌丰度。b组：时间（植物发育）和病原菌的存在对细菌群落组成有很强的影响。c组：病原菌存在和时间（植物发育）对根际细菌群落丰富度（OTU水平）的影响。不同的字母表示P<0.05水平上的差异。d组：无病原菌和现有处理之间在门水平上的细菌丰度差异；*和**分别表示在P<0.05和P<0.01水平上的统计差异。最初，病原体存在和病原体缺失是指材料和方法一节中描述的三个处理组。
温室实验与田间实验结果大多类似，其中存在的不同可能是由于种植土壤的不同以及一些不可控因素导致的。
结论：综上所述，无论土壤理化性质如何，蕃茄青枯病菌的侵染动态都与根际微生物数量、组成和多样性的急剧下降有关。这些结果表明，侵染青枯病菌可能会破坏根际细菌群落的功能，青枯病菌相对丰度可能是青枯病暴发的较好指标，而不是绝对的病原丰度。然而，目前尚不清楚为什么在看似同质的田间条件下，蕃茄青枯病菌的感染呈斑片状，以及多样性的丧失在多大程度上影响根际微生物群的功能，如抵抗二次入侵和促进植物生长。更详细的宏基因组学、测序数据和细菌植物反应以及通过根系分泌物的交流将有助于阐明未来青枯病爆发的原因。
问题思考：本文实验设计上属于常规套路，重点都在分析上，可借鉴的点在于故事思路清晰，分析较为完善，从时间尺度上排除了理化性质对病原菌入侵根际细菌群落组成与多样性的影响。
1.理化性质的影响不容忽视
2.土壤中病原真菌、病毒、线虫与青枯病原菌以及非致病菌的相互作用未考虑在内
3.本实验只对细菌进行了分析，真菌群落是否也因为病原菌的入侵而被破坏进而影响植株发病不得而知。
4.在功能基因预测上分析较浅，能否通过宏基因组揭示入侵机制，在入侵过程触发了哪些功能基因的变化，在其代谢途径、信号通路上的特异表达。
5.进一步是否能在未发病的健康植株根际分离出在病原入侵过程中丰度显著下降以及在网络节点中有重要作用的菌株，进一步说明哪些菌株对青枯菌有好的生防作用。
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