Microbiome/甘蓝型油菜种子微生物群的结构与品种有关，并影响共生体与病原菌的相互作用
题目：The structure of the Brassica napus seed microbiome is cultivar-dependent and
affects the interactions of symbionts and pathogens
甘蓝型油菜种子微生物群的结构与品种有关，并影响共生体与病原菌的相互作用
期刊：Microbiome
IF：9.2
通讯作者：Gabriele Berg
写在前面：
本文将不同品种的种子微生物群与其对细菌种子处理的反应能力联系起来。证明了种子微生物多样性和紧密性与品种的定殖抗性之间的相关性。值得一提的是文章的思路很完善：群落结构分析→体外拮抗实验→温室实验→大田实验→定殖可视化→构建模式图→得出结论，本研究还筛选了一株较好的生防菌CKB26并验证了能力，机理与应用相结合故事才能更加完善。另外丰度较低的种子更容易定定殖菌株可能是因为丰度低的种子中有更多的生态位利于入侵菌株占据，或者种子中微生物互作的结果。
摘要：
背景：虽然植物微生物群对植物健康至关重要，但对种子微生物群的意义知之甚少。在这里，我们研究了不同油菜品种种子相关的本地细菌群落及其与共生和致病微生物的相互作用。
结果：我们发现在油菜种子微生物群中，由紧密的细菌共生网络表达的细菌多样性很高。共发现40个细菌门8362个操作分类学单元（OTUs），其中变形菌门占优势（56%）。被分析的三个品种只有三分之一共享的OTUs。OTUs的共享核心主要由α-变形菌组成（33%）。每个品种都有自己独特的细菌结构、多样性和独特微生物的比例（25%）。细菌丰度、多样性最低、细菌代谢活性预测值最高的品种，种子内潜在病原菌丰度最高。这一数据与该品种幼苗对细菌菌剂种子处理的反应强于其它品种的观察结果一致。具有较高本地多样性的品种对有益微生物和病原微生物具有较高的定殖抗性。我们的结果被种子微生物群的显微图像所证实。
结论：种子微生物群的结构是产生抗病原定植能力的重要因素。它对生物种子处理的幼苗反应也有很强的影响。这些对种子微生物群落结构的新见解将有助于制定结合生物防治和育种方法的下一代战略，以应对世界农业挑战。
提出假设：甘蓝型油菜是一种重要的产油植物。一种病原真菌（ Verticillium Longisporum）被认为是影响芸苔科植物的一种高危病原菌。植物对大多数土传病原体缺乏抵抗力，因此它们的生存依赖于基于微生物的防御机制。这些机制是由植物通过根系分泌物启动和调节的。根系分泌物通过刺激和丰富根际微生物群中的拮抗微生物来保护根系（前面几篇翻译文献有介绍），目前还不清楚种子相关微生物群在这方面的作用。我们假设种子微生物群在两个方面是植物健康的关键因素：
（i）种子内的不同细菌网络避免了病原体的传播。
（ii）紧密的细菌网络导致了定植抗性。
实验设计：
1.16s rRNA测序分析3个品种种子相关微生物群落结构
2.qPCR测定种子中微生物丰度
3.菌株来源
4.体外拮抗实验：上述菌株与病原菌在体外（培养基）进行拮抗实验。
5.种子在发芽带中生长：两个品种（Avatar and Sherpa)种子被三种菌（288P4R、CKB26、315P5BS）预处理，并在无土发芽袋中生长14天，测地上绿色部分重。
注：品种选择是依赖测序结果种子内丰度差异大进行选择；对病原菌的体外抗药性最强的菌株和品种间丰富度不同的属的菌株是首选菌株。
6.温室实验：种子用菌株SB3-1处理→种植在三个土壤（无染病/接种VL病原/野生黄萎病）→监测种子发芽率→10周后生长情况统计
7. 大田实验：采用两个品种（Avatar and Sherpa)进行栽培。使用两种菌株进行处理种子，其中SB3-1采用种子包衣法，HR0-C48采用包埋与生物启动法进行处理。第二年评估疾病情况。
8. 荧光原位杂交观察定殖情况：CKB26 和HRO-C48 荧光原位杂交并用偏聚焦共振显微镜观察定殖情况。、
（译者认为这些实验设计不看结果很难把握，它不是一个可割裂的工作，而是一步步进行的）
主要结果与讨论
1. 种子细菌微生物群结构
图注：研究结构（a）将种子微生物群的细菌多样性与对有益和致病微生物的定植抗性（b，c）联系起来的建议模型。在我们的研究中，我们结合了三种实验方法：生物信息学法、实验性验证法和共焦显微镜原位法。模型（b，c）解释了油菜品种对有益生物处理的反应。我们比较了种子含有高（Sherpa and Traviata）或低（Avatar）细菌多样性的品种。具有较低细菌多样性和较低有益类群数量的种子（如图左侧示意图所示）可以被异源细胞（如蓝棒所示）定殖，其数量高于细菌多样性相对较高的种子（如图右侧所示）。因此，用有益的细菌菌株处理细菌多样性较低的种子可能导致对病原体（描述为棕色真菌菌落）的抗性增加。相比之下，在细菌多样性较高的种子用相同的菌株处理的条件下，幼苗对病原菌的抗性受到的影响较小。该模型适用于具有紧密细菌网络的植物种子，其中引入新的细菌菌株具有相当大的挑战性。
图注：环图显示了与被调查油菜种子相关的细菌群落结构。RDP分类分析是根据每个栖息地四个样本的平均值得出的。环代表不同的分类等级（纲、科和属），列代表不同的分类单元。
三个油菜品种的种子微生物主要包括变形菌门（55.8%），其次是蓝藻菌门（12.7%）和厚壁菌门（7.3%）。最丰富的类群是α-变形菌（26.4%），其次是β-变形菌（17.8%）和γ-变形菌（10.6%）。所有样本中鉴定出的OTUs总数为8362个（以97%的一致性测量）。这一数量比Links等人在油菜种子表面微生物中观察到的OTUs数量高34.5%。然而，它比Baret在发芽的油菜种子的微生物组中发现的数量低30%。
2.种子的核心与特定微生物
油菜种子微生物群（左）和核心种子微生物群（右）的分类结构。分类结构（n=12）在97%的OTU截止水平上被检索。核心微生物群中每个门的相对丰度如右方括号所示。每个细菌类名下括号中的数字表示其对整个核心微生物群的贡献。主要门在三个品种的种子中都发现了变形菌门。De Campos等人在油菜根际细菌群落中观察到了大量的细菌。Barett等人建立了甘蓝变形菌作为芸苔属种子微生物群的主要代表。这类细菌占整个芸苔属种子微生物群的50%以上，然而，我们的研究表明，蛋白质细菌类（24.6%α、17.8%β和10.6%γ-蛋白杆菌）之间的分布更加均匀。这说明变形菌是芸苔属种子的优势种与核心种。
3.细菌群落丰度与多样性分析
图注：种子微生物群落总体多样性（左）。油菜细菌16srRNA基因β多样性的测定（右）。β多样性群落聚类是观察系统发育β多样性指标。在图中，每个点对应于Avatar（红色三角形）、Traviata（橙色正方形）或sharpa（蓝色三角形）种子样本。由绘制的主坐标解释的变化百分比显示在轴上。
表头油菜种子内源微生物群的总体丰富度
4. 品种中假定有益/致病微生物的相对丰度和PICRUSt 预测功能的功能冗余
表注：a：在可能的情况下，在属级进行OTU命名。未划分属级的分类单元被命名为已知的最低分类单元，后面紧跟着“-”。对于标记有星号的分类群，对最丰富的OTUs的代表序列进行了 BLAST。这项任务是基于最高的分数和至少99%的身份。如果出现几个具有相同得分的分类群，都会被鉴定。
b：最丰富的20个分类群的相对丰度（在品种和重复中的中位数）。其中一个品种的分类群与另外两个品种相比有显著差异（根据Tukey-HSD-t检验，p<0.05），用斜体突出显示。根据Tukey-HSD-t检验，用相同字母表示的值没有显著差异（p<0.05）（这里译者认为比较行列显著性，用大小写区分更好，斜体并不容易看出来）。
C：一些已知的分类群菌株的假定功能（译者认为假定功能在种子中互作是否有利不得而知）
d：在网络分析显示的统计显著（p<4×10-4；q<4×10-4）共现模式中，分类群的参与被标记为“是”，否则为“否”。
在三个品种的种子中，我们比较了对植物有益的主要门的丰度。11个有益菌门中有9个门在Avatar中丰度低于Traviata与sharpa，其中四个门（酸杆菌、氯弯菌、浮霉菌和装甲菌）在Avatar中的含量明显低于其他两个品种。按属级分类的分类群共有747个不同的分类群，而不同品种间有80个不同的分类群（非参数方差分析Kruskal-Wallis检验，p≤0.05）。在所有种子品种中发现的20个最丰富的属中，9个是公认的有益属，3个属（前面有文章介绍青枯菌属、沙门氏菌属和欧文氏菌属）被认为具有潜在的植物致病性。在这些分类中，与其他品种相比，Avatar品种中有6个显著增加，2个显著减少。在Avatar种子中发现的5个高丰度的属被归为被认为有益的分类群：伯克霍尔德亚科、慢生根瘤菌科和中慢生根瘤菌。另一方面，与其他两个品种相比，有益于植物的假单胞菌在Avatar种子中的含量较少。值得注意的是，植物病原菌青枯菌在Avatar中也明显更为丰富。大多数预测的细菌功能在品种的微生物群之间是相似的并表明功能高度冗余。Avatar种子菌群的几种预测功能与Traviata与sharpa种子菌群不同。例如，在Avatar品种中发现一些氨基酸、苯甲酸盐、乙醛酸盐和二羧酸盐、氨基苯甲酸盐、谷胱甘肽、柠檬烯、蒎烯、香叶醇、氯烷烃和氯烯烃的代谢或降解功能发生改变。α多样性分析显示，与三个受试品种种子相关的预测微生物功能丰富度水平没有显著差异。值得注意的是，阿凡达品种在预测的微生物功能的丰富程度上没有显著下降。微生物组内的功能多样性被认为比结构多样性更重要[2]。对细菌功能的皮锈菌预测表明，与其他两个供试品种相比，Avatar种子中的几种代谢途径有显著差异。这可能表明与该品种相关的细菌细胞内的代谢活动速率较高。
5. 种子微生物互作网络
图注：油菜种子微生物群间存在显著的共生和互斥关系。每个节点代表一个细菌目，描述一个或多个属级系统发育类型。如果OTU的鉴定不是在属级上进行的，则在名称后显示更高级别的分类群并标记为“_”。当多个otu被分配到同一个分类单元时，数字（1-2）被添加到名称中以区分节点。结的颜色与门相对应（蓝色变形细菌、红色厚壁菌、橙色拟杆菌、青色放线菌），而结的大小与其程度成正比。只有显著的相互作用（p<4×10-4；q<4×10-4）。边缘宽度与支持证据的显著性成正比，颜色表示关联的标志（红色阴性，绿色阳性）。a中的图像显示整个网络，突出显示b中放大的网络部分。
参与显著交互作用的类群主要是变形菌（59.2%），其次是厚壁菌（14.1%）、拟杆菌（12.7%）和放线菌（4.2%）。在观察到的几种正相互作用中，我们发现伯克霍氏菌的一些成员与稀少的疏杆菌科和中慢生根瘤菌有很强的共生关系。另外我们发现至少有一个属于植物病原性青枯菌的OTU的发生与固氮和磷活化的红螺菌和植物有益的醋杆菌科的发生呈负相关。一些属于赤芍科（通常以有益菌株的数量多而闻名）和嗜氨菌科（具有不确定功能）的OTU的出现与两种不同的OTU（中慢生根瘤菌）的出现呈负相关。
通过对细菌网络的分析，我们发现共现而不是共排斥是根微生物群成员之间关系的特征。我们能够确定，大量优势类群持续存在，并与彼此和一些小类群共同发生。将我们的研究与其他研究进行比较，我们可以推测，油菜种子的微生物群落结构特别紧密。这可能部分解释了在油菜生物防治策略的发展过程中遇到的挑战，因为新菌株更难侵入从种子中获得的紧密结合的细菌群落。种子生产实践、储存条件和其他非生物因素的变化可能在一定程度上导致种子之间种子微生物群的变化。
6. 微生物条件下细菌种子处理对品种的依赖性反应。
预选菌对病原菌的拮抗作用
图注：三个选择菌株（CKB26、315P5BS和288P4R）对油菜种子萌发袋中2周龄幼苗生长的影响。绿色部分的鲜重和幼苗发芽率显示在a中，而每个菌株在种子（log10CFU /seed）和根（log10CFU/ root）上的丰度分别显示在b和c中。
结果表明CKB26是真菌病原体的最强拮抗剂，在两种假单胞菌处理的情况下，与sharpa幼苗相比，生长在无微生物与土壤条件下的Avatar幼苗对细菌处理表现出更强的阳性反应。我们观察到用315P5BS处理的Avatar和sharpa幼苗在促进植物生长方面有显著差异。315P5BS处理Avatar幼苗比sharpa幼苗产生更多的生物量。两个品种与未经处理的植株相比没有显著差异。除CKB26两个品种对种子和根系定殖的影响差异不显著。CKB26定制的Avatar种子的丰度明显高于sharpa。
7.土壤细菌种子处理对品种的依赖性反应
图注：选择的菌株（Sb3-1、HRO-C48、HRO-C48另一种处理）对大田条件下生长的植物发芽率和黄萎病侵染程度的影响。在瑞典的Kärrarp（a，c）和Lockarp（b，d）种植了油菜籽品种Avatar和Sherpa。图a、b显示了定义为“每平方米植物数量”的发芽率，而图c、d显示了定义为受侵染植物与总植物数量之比的疾病率。根据Tukey-HSD-t检验，用相同字母表示的值没有显著差异（p<0.05）
Sb3-1对盆栽油菜品种Traviata、Avatar和Sherpa 7周生幼苗的抗真菌作用
我们观察到Avatar和sharpa幼苗对两种菌株处理的反应存在差异，这两种菌株强烈依赖于位置。在具有自然黄萎病感染史的Lockarp田间，用HRO-C48生物引发种子后，Avatar品种的发芽率显著提高。在相同的处理条件下，sharpa品种的发芽率没有提高。在人工感染黄萎病菌的田间，Sb3-1处理对两个品种的幼苗萌发都有显著的负面影响。在田间试验中，与对照组相比，黄萎病的感染率没有显著差异，但是，用Sb3-1处理的Avatar品种的植物感染率较低（d）。种子处理对总产量没有显著影响。这一结果可能与Avatar种子中假单胞菌的丰度明显低于sharpa种子中的丰度有关。另一方面，用288P4R处理没有产生任何可测量的促进植物生长的效果。很容易推测，伯克霍氏菌的总体较高发生率（三个品种的平均发生率为0.025%）是导致288P4R对幼苗生长没有任何影响的原因。综合前面结果从而得出Avatar种子微生物群的普遍低丰度、高预测代谢活性和重要有益门丰度的降低是导致其对病原体易感性的因素。
8.油菜种子和幼苗细菌群落的定殖规律
图注：CLSM法观察未处理（a）和生物处理过的CKB26（b）和 HRO-C48（c）油菜种子以及油菜幼苗根际（d）和叶际（e）的细菌定殖模式。a、b中的菌株使用FISH-CLSM，使用标记有Alexa488（蓝色）的α-变形菌特异性ALF968探针和标记有荧光染料Cy5（红色）的等摩尔比的真细菌探针EUB338、EUB338II和EUB338III进行可视化。在c中，用BacLight活/死染色法在3D投影中显示活（绿）和死（红）的 HRO-C48。为了在（d）和（e）中显示CKB26，用荧光染料Cy5（绿色）标记的γ-变形菌特异性FISH探针GAM42a与荧光染料Cy3（红色）标记的真细菌探针EUB338、EUB338II和EUB338III的等摩尔比重叠。细菌菌落用箭头突出显示。刻度尺10μm。
我们能够在未染色的种子中看到少量的细菌细胞。它们主要以单个细胞或2-5个细胞组成的小群出现（图a）。检测到的细菌属于α-变形菌（图a，左）或其他真细菌（图a，右）。与未经处理的种子（图a）相比，用CKB26（图b）和HROC48（图c）处理的种子含有明显更多的细菌细胞。经 HRO-C48处理的种子中观察到的大多数细菌都是活的（图c）。在细胞外（图b，左）和细胞内（图b，右）都发现了细菌细胞。用CKB26菌株处理油菜种子，成功地定殖了幼苗的根际和叶际（图d和e）。与前面定殖情况结合来看表明在种子萌发前，内生细胞不能在失活的种子中繁殖和形成菌落。另外，不同品种根系的差异可归因于有益微生物和致病微生物在种子定殖上的差异。因此，品种的种子微生物群可能会对植物的生长以及它们各自的生物和非生物胁迫耐受水平产生影响。总之，我们对油菜种子微生物组的结构和功能方面的观察证实了我们的假设，即油菜种子微生物组具有品种特异性。
结论：
油菜种子微生物群具有品种特异性，反映了育种的影响。这表明品种影响了与共生体和病原体的相互作用方式。种子微生物群的结构决定了植物对病原菌建立定殖抗性的能力，因此是育种策略的一个有趣的生物标记。我们建议在育种策略中包括种子微生物组的研究。此外，我们相信，结合网络分析的种子微生物群评估可能为在品种水平上有针对性地选择特定寄主植物的生防菌株提供新的机会。这些对种子微生物群落结构的新见解将有助于开发结合生物防治和育种方法的下一代策略，以应对世界农业挑战。
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