Microbiome/番茄根相关微生物群与寄生性疫霉病
点击蓝字关注我们
题目：Tomato root microbiota and Phytophthora parasitica-associated disease
番茄根相关微生物群与寄生性疫霉病
期刊：Microbiome （2017）
IF：9.2
通讯作者：Eric Galiana
摘要：
背景：致病性卵菌与寄主植物根表面的微生物之间的相互作用是未知的，尽管对接种体的构成至关重要。探讨了寄生于多食性和土地性植物疫霉病之间相互作用的性质。
结果：利用16s rRNA基因的深度测序，对番茄根际微生物区系组成进行了分析。卵菌在寄主根表面的定殖与微生物群落的变化有关，包括拟杆菌/变形菌的变化，另外，黄杆菌科作为最丰富的科。通过筛选能够（i）寄生性疫霉病原菌在培养基上生长，（ii）在体外对卵孢子菌具有益生菌或抗生素活性，（iii）三重作用（假单胞菌-病原菌-细菌）下对卵孢子菌感染周期有影响的细菌，鉴定了寄生疫霉病原菌相关微生物群中干扰生物学和卵菌感染的成员。在番茄植株中发现一种假单胞菌系统发育型菌株可加重病害症状。寄生疫霉病原菌效应子对假单胞菌缺乏明显的基因表达反应，表明植物易感性的增加与毒力的增加无关。我们的结果显示假单胞菌与卵菌建立了共生关系。细菌优先定植在生物膜的表面，而不是根部，这样它们就可以感染植物细胞，而不会明显感染寄生疫霉病原菌。
结论：番茄根际寄生致病性卵菌P.parasitica的存在导致根际微生物组成发生变化。它通过卵菌和细菌之间的物理联系，促进假单胞菌物种的栖息地扩展。
目的与意义：
与宿主和病原体相关的微生物群调节着感染过程，致病性的问题不再局限于单一基因型或物种水平，而是扩展到代表致病实体的微生物群水平，原体和寄主附近的微生物群落形成的混合物种生物膜是很好的模型。它们构成了一种适应，既能保护物种不受波动条件的影响，又能促进物种间的分子交流。致病性卵菌是真核和丝状的微生物，感染各种宿主（植物、昆虫、脊椎动物和其他微生物）。疫霉属和腐霉属的植物病原菌以及一些专性寄生虫（霜霉病和白锈病）在许多双子叶植物上引起高度破坏性的疾病。疫霉菌现已经进化出抑制PAMP引发的免疫（PTI）的能力（植物先天免疫）。卵菌在感染前与宿主菌群相互作用，卵菌群与本地微生物群相互作用对致病性的贡献在很大程度上是未知的。例如根际微生物组就可能会促进植物染病或有助卵菌繁殖（译者前面翻译的Ecology Letters /方便植物相关微生物群落入侵就能为本文做一个很好的支撑）。
两个假设：这篇报道试图探讨番茄根被寄生P.parasitica感染后根际微生物群组成的变化。这个问题是通过分析根表面卵菌形成的生物膜内的相互作用来解决的。两个方面：
1.根际微生物群是否有一个子群能够与卵菌相互作用并影响植物病害的发生。
2.对能够定植生物膜的细菌的疾病周期发生率进行依赖于培养的功能分析。
实验设计：
三种土壤种植番茄6周后采集根际土（R1，R2，R3） → 蕃茄（2周）根（无菌）与P.parasitica孵育 → 将根（接种P.parasitica/没有接种）置于用（R）中根际土与无菌水上清液中 → 3天后收集根（M1R1，M1R2，M1R3）与生物膜粗聚合物（M2R1，M2R2，M2R3）用于宏基因组测序与筛选 → 从M2中继续筛选分离 → pFK78质粒标记细菌后接种生物膜复合物 → 温室验证（P.parasitica接种番茄根再接入质粒标记的细菌在温室生长，评估其发病情况） → real-time qPCR生物膜中基因表达，并提取生物膜总RNA。
实验主要结果与讨论
1. P.parasitica相关微生物群落结构
图注：三个M1和M2重复的观测OTU丰富度的稀疏曲线，OTU阈值≥97%。按门分组的高可信OTUs百分比：变形菌菌（蓝色）a和拟杆菌（红色）（左图）；Latescibacteria（紫色）、放线菌（橙色）、厚壁菌（蓝色）、疣状芽胞菌（深粉色）（右图）。C图是基于Hellinger距离的PCA排序。
在所有样本中，最丰富的组被充分覆盖，超过97%的序列被分配到变形菌或拟杆菌，以及有限数量的otu被分配到额外的门，包括厚壁菌和放线菌（图b）。事实上，已知所有这些门都具有许多根际微生物群的特征。
图注：左图表示M1或M2中变形菌（a）、α-变形菌目（b）和拟杆菌纲（c）的相对丰度直方图（百分比±标准差）。M1和M2之间的差异对α-变形菌（p=0.03）和鞘脂单胞菌目（p=0.05）有显著性意义。右图表示M 1和M 2最丰富的10个科的相对丰度直方图（百分比+标准差）（阈值>0.5%），存在（浅灰色）和不存在（深灰色）P.parasitica生物膜。A:α-变形菌。B：γ-变形菌。C：拟杆菌。
结果表明，卵菌在根表面的存在导致了拟杆菌门丰度增加（M1和M2分别为33%±10.8、45%±5.2）和属于变形菌门丰度降低（M1和M2分别为63%±10.1、52%±3.9）。此外，我们的研究结果还表明卵菌对根际微生物有一定的影响。四类变形菌纲分布显示α-变形菌丰度显著降低（p=0.03）（左图a）；鞘脂单胞菌目显著减少（p=0.05）（图左b）在很大程度上支持了这种降低。α-变形菌科相对丰度的降低也被发现与鞘脂单胞菌目中鞘脂单胞菌科（p=0.04）和生丝微菌科（p=0.02）和慢生根瘤菌科（p=0.03）（右图）。在拟杆菌中，M1和M2中发现的大多数OTU与黄杆菌属（图左c）有关，黄杆菌科是最丰富的科（图右c）。因此，黄杆菌科支持与卵子菌存在相关的拟杆菌较高的相对丰度（M2 vs.M1，p=0.07）。研究结果表明，寄生P.parasitica与根表面微生物组成中的拟杆菌/变形菌转变有关。拟杆菌在番茄根中的定殖作用主要受寄生P.parasitica侵染。寄生P.parasitica对寄主植物的感染依赖于植物细胞壁降解酶的分泌，这些酶导致寄主成功地渗透并随后获得营养素。卵菌群有效解聚多糖的能力有助于观察到拟杆菌在寄生P.parasitica相关微生物群中的富集。
2. P.parasitica与M2细菌的伙伴关系
图注：细菌分离物分析。在V8提取琼脂培养基上对P. parasitica (P) 和M2株（I-1G6、I-3G9、I-1E12和I-1G3）进行平板对抗试验。b在接种游动孢子后不同天数（○）或与P. parasitica 三方相互作用E. coli (□),I-3G9 (●), I-1E12 (▲), I-1G6 (♦), or I-1G3 (■)的疾病发生图。在3、5、8和13天（dpi）分别监测不同植物的病害症状。I-3G9和I-1E12在3和5dpi时的疾病指数与E. coli 和模拟接种不同（n=5， t检验，0.004<P<0.035）。数值是两个复制品的平均值±标准偏差。
M2中分离了1200株分离物。共对300株进行了体外与体内实验，在营养琼脂平板上的对抗试验中，11%的分离物抑制（9.8%）或促进（1.2%）三种不同寄生P.parasitica菌株的径向生长（图a）。可能是分泌的代谢物对其产生了影响。测序发现三个系统发育类型属于假单胞菌属，一个属于肠杆菌属。采用共接种试验系统检测了20株番茄根腐病菌对番茄根侵染能力。每一个分离物都被直接应用于根部，在长达14天的时间里，没有发现任何一个在叶片或植株根部引起症状。分离物对卵菌生长的影响与体外培养无关。事实上，对于所有分离株来说，在孢子接种后2小时施用类似的根并不能对植物产生有效的保护作用。四株属于假单胞菌系统类型II和III的菌株出现症状恶化。在接种了游动孢子与（大肠杆菌与游动孢子）共接种的对照植物中，症状出现和发展的速度快于症状出现的速度。接种后第3天和第5天，两个菌株的发病率显著高于对照组。
3.假单胞菌优先定植P.parasitica生物膜并感染植物细胞
图注：I-1G6-GFP的定位。
在3hpi（A），48 hpi (D，E), and 8 dpi (F)时，1G6-GFP细胞在生物膜（b）上相对于根（r）的优先位置的显微照片。I-1G6-g f p在3hpi（A）8dpi（F）上的定殖可分别与大肠杆菌GFP（B）和（G）上的较小定殖相比较。（C）I-1G6-GFP和E.coli-GFP在3和24hpi下的相对荧光强度直方图，测量为生物膜表面和根系的平均值之比。（E）虚线描绘了被I-1G6-GFP感染的表皮细胞，位于生物膜下。
早期I-1G6-GFP细菌细胞沿根表面分布不均匀，主要分布在生物膜上，形成半球形或套筒形生物膜。荧光强度的定量分析表明，生物膜的定殖比根系表面的I-1G6-GFP优先。对于大肠杆菌GFP菌株，与根表面相比，生物膜表面的定殖更为稀疏且不具特异性（图B，C）。在2dpi时，I-1G6-GFP细菌可能在根表面和生物膜结构之间的界面处聚集（图D），并且还观察到靠近生物膜的植物细胞的感染（图E）。在8dpi时，生物膜的优先定殖很明显（图FG），在根皮层中观察到广泛的细胞间生长I-1G6-GFP，主要沿着根的纵轴。在不同时间点，与植物细胞相反，未观察到寄生疟原虫的细胞内感染事件。
4.假单胞菌不诱导P.parasitica效应基因调控
图注：P.parasitica对I-1G6-GFP的基因表达模式。用游动孢子孵育3h后，2周龄植株的根被P.parasitica覆盖。然后将它们在水中或存在I-1G6-GFP的水中。定量接种 PPMUCL1,PPMUCL2, PPMUCL3（Ａ图）PPTG03562, PPTG02949, PPTG4818 (Ｂ图) PSE1(Ｃ图)后（２，６，２０小时）mＲＮＡ丰度，t检验显示模拟和接种的情况没有显著差异除了PPMUCL1, PPMUCL2, PPTG4818 (p= 0.01, 0.02, and 0.04, respectively)在２小时的丰度。
先前对P.parasitica生物膜转录体的研究导致了对编码（i）PPMUCL家族的类粘蛋白的转录物的鉴定，（ii）果胶裂解酶（PPTG03562/02949/4818）的鉴定，该酶被鉴定为参与果胶的降解，植物细胞壁的成分，RxLR效应器PSE1在穿透附着体中积聚。为了研究感染早期假单胞菌基因表达的影响，采用定量RT-PCR方法研究了I-1G6定殖生物膜根复合物的动力学。图显示了三类基因在不同时间点的mRNA变化。I-1G6菌株的存在似乎不会影响基因的表达水平，尽管在定植后2-20小时表达水平略有下降。我们的结果表明，在三者相互作用的早期阶段，评估的转录物的丰度并没有因假单胞菌定殖生物膜而上调。我们的结果表明，在三者相互作用的早期阶段，评估的转录物的丰度并没有因假单胞菌定殖生物膜而上调。有研究表明，拟杆菌在土壤中的丰度与碳矿化率呈正相关，受卵菌通过果胶消化的影响。在生物膜形成的根部，植物细胞壁的局部降解应构成土壤黄杆菌科的有利生态位，黄杆菌科是M 2的优势科。在黄杆菌科中，基因组表现出高丰度和多样性的与碳水化合物代谢有关的基因，如木糖、阿拉伯糖和果胶。在生物膜中表达量最高的前20个基因中，编码果胶裂解酶的3个基因的表达增加，与果胶消化能力和拟杆菌富集之间的因果关系一致。
回应假设：这些结果表明，细菌增强了卵菌的致病性或卵菌增强了假单胞菌的感染性/致病性。需要进一步的研究来区分这些不同的假设。然而，我们的结果表明卵菌感染可能促进假单胞菌的机会性感染。第一个假设已经在转录组水平上通过分析为结构功能招募的目标基因的基因表达或通过暴力和隐形感染模式进行了评估。在卵菌侵染过程中，细菌-卵菌相互作用对基因的mRNA丰度没有影响。另一方面，第二个假设得到了细菌在寄生P.parasitica感染部位的位置的支持，而寄生P.parasitica感染部位有利于卵菌的优先粘附，它也支持邻近植物细胞的假单胞菌感染。假单胞菌条件致病菌可能已经获得了粘附卵菌的能力，以最大限度地获得植物营养。在伤口处，卵菌物质将构成这个科的细菌获取营养物质的入口。从病理学的角度来看，拟杆菌/变形菌群落的转移是否/如何干扰卵菌的感染周期的问题仍然是一个悬而未决的问题。我们的研究从功能上评估了P.parasitica相关细菌的作用，并测试了通过培养独立分析产生的假设。根生物膜复合物M2的筛选使我们得以鉴定假单胞菌科的成员、10个最丰富的微生物家族之一（OTU隶属率为3.7%）和肠杆菌科的分离物；代表M2微生物多样性的低部分的家族（OTU隶属率为0.009%，数据未显示）。而M2中未检出拟杆菌菌株。需要进一步的研究来设计有效的筛选方法，从P.parasitica相关微生物群中分离出拟杆菌菌株。
结论
在卵孢子菌感染过程中，微生物群的组成发生了显著变化。宿主-卵菌相互作用的建立以拟杆菌内类群相对丰度较高和变形菌相对丰度较低为特征。本研究进一步说明卵菌和机会菌之间合作的一个方面，证明卵菌感染扩大了假单胞菌对寄主植物组织的栖息地可用性。通过微生物遗传学和功能分析，对卵菌表面细菌粘附的机理和感染资源配置的可能优化进行了深入研究。
总结
文章通过分析根表面有/无寄生疫霉形成的生物膜覆盖的番茄的根际菌群组成；发现寄生疫霉定殖的番茄，根际菌群的拟杆菌门（升）/变形菌门（降）比例改变，黄杆菌科丰度最高；通过筛选可在基于寄生疫霉提取物的培养基中生长、对寄生疫霉表现出体外益生或抗生素活性、可影响寄生疫霉感染周期的细菌，鉴定出一种假单胞菌种系型（phylotype）可恶化番茄植株的疾病症状；细菌更倾向于定殖于寄生疫霉形成的生物膜的表面。
另外，根际作为植物与土壤交流界面上最重要的生态系统，生物膜的形成对根际微生物的组成与功能也发挥着重要作用。生物膜的形成一般经历4各阶段：黏附，微群落的形成，微群落的成熟，微生物的释放，周而复始。研究根际微生物相关的生物膜的结构与功能也是当下的一个热点。
本文可借鉴的点在于根相关生物膜的筛选分离纯化等技术，以及后期验证菌群功能。不足之处是没有对病原以及促进病害的细菌导致的病害发生提出解决途径与管控方法。
微信号 : lida179438448
点击阅读原文可下载原文
● 扫码关注我们