Geoderma/豆科植物根际细菌群落的复杂性促使菲的降解
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题目：Complexity of bacterial communities within the rhizospheres of legumesdrives phenanthrene degradation
豆科植物根际细菌群落的复杂性促使菲的降解
期刊：Geoderma
IF：4.2
通讯作者：陈卫民
摘要：
确定复杂的植物-微生物相互作用和反馈机制是有效修复污染土壤的关键。利用10种常见豆科植物根际细菌群落对石油污染土壤中菲的降解进行了研究。分析了细菌群落结构，揭示了PHE（菲）降解能力变化的机制。结果表明，根际细菌β-多样性对PHE的降解速率起着重要的预测作用，且较复杂的菌群表现出较高的PHE降解能力。石油污染土壤中的小冠花和豇豆菌群对菲的降解率最高（接近80%）。土壤细菌α-多样性差异不大，但在可耕土壤和污染土壤之间，以及不同豆科植物根际和非种植土壤之间，细菌群落组成存在显著差异。受污染土壤细菌群落中潜在的降解相关类群更为丰富，说明受污染土壤PHE的降解比耕地土壤中更为有效。网络分析揭示了潜在降解相关分类群在维持细菌分类群间复杂联系中的重要生态作用。石油污染降低了高低pH根际土壤细菌群落组成的差异。这些结果表明，制定有效的根际修复策略应通过选择最佳的植物-微生物群落组合，关注来自老化石油污染土壤的根际栖息生物之间更加多样和复杂的相互作用。
背景与意义
1. 多环芳烃（PAHs）是一类在全球环境中普遍存在的有害有机污染物，多环芳烃污染通过对土壤理化性质的负面影响威胁农业生态系统的生产力。
2. 根修复是一种有前途的、经济有效的绿色技术，它利用植物和根际微生物之间的协同效应来消除土壤中的污染。
3. 以往的研究主要集中在单一或几种植物的根修复上，然而，基于这种方法很难系统而详细地了解根修复中复杂的微生物和生态机制。细菌多样性和根际群落对污染物的降解率之间的关系尚待研究。
4. 豆科植物具有区别于其他植物群的独特特性。它们通过与固氮根瘤菌的共生活动形成根瘤，导致豆科植物与其根相关微生物群之间的特定关联，目前尚不清楚不同豆科植物是否以类似的方式在未受污染或老化的污染环境中形成微生物群落，以及根际土壤在污染遗留效应下是否表现出不同的多环芳烃降解率。
5. 主要目的是评估未受污染的耕作土壤和老化的石油污染土壤中的豆科植物根际细菌群落对多环芳烃降解的影响，并探讨多环芳烃降解能力变化的机制。结果将有助于了解豆科植物多环芳烃根际修复的微生物和生态机制，揭示根际抑制微生物之间复杂的相互作用。
实验设计：
1.采集两种土壤①受污25年土壤，干燥土壤中的总石油烃浓度为2.94 g/ kg。②污染区附近未检测到菲的耕地土壤。
2.采集到的两种土壤过筛混匀后分别种植十种豆科植物（红三叶草（Trifolium pratense），毛野豌豆（Vicia villosa Roth），小冠花（Coronilla varia），豇豆（Vigna unguiculata），薇菜（Vicia sepium），锦鸡儿（Caragana korshinskii），紫花苜蓿（Medicago sativa），百脉根（Lotus corniculatus），刺槐（Robinia pseudoacacia），草木犀（Melilotus miller））与一份不种植物的对照。
3.生长90天后收集根际土（提取DNA后16s rRNA测序分析群落结构）与植物部分（根长，茎高，结瘤数与干重）
实验主要结果与讨论
1. 可耕土壤和石油污染土壤中豆科植物的生长
一般来说，大部分豆科植物的生长在可耕土壤和石油污染土壤之间没有显著差异。油污染土壤中豇豆的根长明显低于耕地，红三叶草的根长则相反。紫花苜蓿在油污染土壤中的根长、茎长和干重比在可耕土壤中的低。此外，油污染土壤中种植的豆科植物结瘤数明显低于可耕土壤中种植的豆科植物。我们观察到大多数豆科植物的生长不受油污染的影响。这可归因于豆科植物对污染环境的强烈适应性。尽管如此，大多数豆科植物的结瘤都受到石油污染的严重影响，这表明在石油污染下豆科植物的生长可能不需要与根瘤菌共生，而其他特殊的营养代谢途径可能是有利的（译者认为探究在石油污染条件下豆科植物作用下其他有利代谢的微生物作用机制也是一个很好的方向）。
2.细菌多样性与菲降解的关系
图1注：豆科植物根际细菌β-多样性对菲降解的影响。（A） 豆科植物根际细菌群落对菲的降解速率，以及对可耕土壤和石油污染土壤的非种植处理。豆科植物的黑体名称代表豆科植物根际与非种植土壤的显著差异（p<0.05；Wilcoxon秩和检验）。星号代表了可耕地土壤和石油污染土壤之间差异的显著性（p<0.05；Wilcoxon秩和检验）。（B） 土壤样品β-多样性的非度量多维标度（NMDS）分析，每组有80%的置信椭圆。采用ANOSIM试验，研究了土壤和石油污染土壤以及不同植物之间细菌群落样本的群落相似性。（C） 估计了可耕土壤和石油污染土壤细菌群落在操作分类单位（OTU）丰富度上的差异。（D） RF是指细菌α-和β-多样性指数作为PHE降解率预测因子的重要性。对每棵树计算重要性度量的准确性，并对整个森林（5000棵树）进行平均。显著性水平如下：**p<0.01。α丰富度，OTU丰富度；αShannon，Shannon指数；β-NMDS1，非度量多维标度分析的第一轴；β-NMDS2，非度量多维标度分析的第二轴。变量的均方误差（MSE）百分比的增加被用来估计预测因子的重要性，较高的MSE%值意味着更重要的预测因子。（E和F）每对土壤样品的OTU丰富度（E）和细菌β-多样性（F）与PHE降解率之间的关系。估计线性最小二乘回归关系。（译者认为在一些微生物作用能力中，用一些现有的指标去进行预测是一大亮点，如果能自己制作科学易懂的数学模型或公式指标进行预测评估将是更大的创新）
污染土壤中小冠花根际群落的菲降解率最高，平均为79.8%，其次是豇豆（菲降解率为74.9%）。在污染土壤中种植的豆科植物根际群落中，大多数的菲降解率高于种植在可耕土壤中的豆科植物。在污染土壤中，小冠花、豇豆、百脉根、红三叶草和锦鸡儿根际群落的PHE降解率高于未种植处理。然而，在可耕土壤中，除小冠花、豌豆和红三叶草外，大多数根际群落的菲降解率高于未播种处理。在非种植处理中，受污染土壤细菌群落的菲降解率显著高于可耕土壤细菌群落。基于97%的相似性，将3802434个质量序列聚类为7533个操作分类单元（otu）。变形菌（48.1%）、放线菌（20.9%）、酸杆菌（8.6%）和拟杆菌（5.2%）占序列的最大比例。优势属有剑菌属、新鞘脂菌属、诺卡氏属、链霉菌属和根瘤菌属。非度量多维尺度（NMDS）分析表明，可耕地和石油污染土壤中的细菌群落在排序空间中形成不同的簇，在分类水平上观察到显著差异（相似性分析[ANOSIM]检验；图1B）。此外，除了种植百脉根和草木犀的土壤根际，不同豆科植物根际和非种植土壤的细菌群落结构也存在显著差异（ANOSIM检验，p<0.001）。可耕土壤和污染土壤的OTU丰富度没有显著差异。大部分土壤根际OTU丰富度低于未播种处理。（这里译者认为空白对照应当加上种植非豆科植物做植物对照，这样下来的显著差异才能对豆科植物的特殊贡献性提供有力证据）。为了确定影响菲降解的因素，我们进行了随机森林（RF）分析，以确定菲降解率的主要微生物预测因子（图1D）。我们观察到细菌β-多样性在预测菲降解率中起主要作用，线性回归分析的结果也支持这一点。OTU丰富度与菲降解率之间没有显著关系（图1E）。相反，细菌β-多样性与PHE降解率呈显著正相关。一般而言，受油污染土壤细菌群落的β多样性显著高于耕地土壤细菌群落的β多样性，但在百脉根中差异不显著。结果还表明，与耕种土壤相比，石油污染土壤中细菌群落的PHE降解率更高。
我们观察到可耕地土壤和受污染土壤之间的细菌α-多样性差异很小，这与之前的研究结果不一致，即石油污染降低了细菌多样性。这种差异可能是由于微生物在长期受到污染的环境中具有很强的进化适应性。此外，豆科植物的生长降低了土壤根际的细菌丰富度，这与之前的研究结果一致，这可能是由于某些分类群的富集和其他分类群的丧失，这取决于根分泌物。相反，来自可耕地和受污染土壤的细菌群落在群落组成上表现出显著的差异，这意味着长期的石油污染可以促进具有菲降解能力的本地微生物的重组（在这里如果能找到污染不同年份的土壤进行豆科植物的种植与分析，对于揭示豆科植物根际微生物对石油污染菲降解能力的时空演变机制进行一个更好的探讨）。
图注2：耕地土壤和石油污染土壤细菌群落β多样性比较。所有豆科植物根际细菌群落β-多样性的两两比较（单独比较）和未种植处理的土壤与石油污染土壤之间均显示出显著差异（p<0.05；Wilcoxon秩和检验）。根据Wilcoxon秩和检验，可耕土壤和石油污染土壤中细菌群落的总体β多样性（“整体”）显著不同（**，p<0.001）。
我们观察到污染土壤中的细菌群落对菲的降解效率更高，这表明污染土壤中富含具有菲降解能力的微生物。与可耕土壤相比，石油污染土壤中的细菌群落也具有更丰富的潜在降解相关类群，这也意味着丰富的类群可能在菲降解中发挥关键作用。大多数潜在的降解相关类群已被报道为污染物降解物。
3.与菲降解相关的细菌系统类型。
图3注：基于Spearman相关分析的细菌类群共发生网络。显示了降解富集（Enrich）和其他（others）分类群（A）的有色共生网络。一个关联表明一个强（Spearman'sρ>0.7）和显著（FDR校正p<0.01）的相关性。每个节点的大小与otu的相对丰度成正比；两个节点（即边）之间连接的厚度与Spearman相关系数的值成正比。（B） 不同类群特有的节点级拓扑特征，特别是相对丰度、度中心度、中间中心度和紧密中心度。根据Wilcoxon秩和检验，两个分类群之间的所有特征都有显著差异（p<0.001）。
根据细菌群落丰度与菲降解率之间的显著正相关（Spearman），确定了可能参与菲降解的细菌系统类型。共有810个被鉴定为潜在降解相关类群。基于相关性建立了元群落共现网络，揭示了1227个细菌分类群中65717个关联（图3A）。可能与菲降解有关的分类群和其他分类群形成独立的模块。我们研究了不同分类群之间节点级拓扑特征的差异，包括程度中心性、中间中心性和紧密中心性（图3B）。在潜在降解相关类群中，测定值显著高于其他类群（p<0.001）。为了证实上述观察结果，我们生成了不同分类群的子网络（如潜在退化相关的和其他的），并计算了一组网络级拓扑特征。在菲降解富集的子网络中，平均度、聚类系数和图形密度均较高，说明潜在降解相关类群之间的联系更紧密（上表）。此外，在富集的子网络中，平均路径长度和直径较低，表明潜在降解相关分类群之间的联系更紧密。在石油污染土壤中发现了更多与烷烃组分降解相关的功能基因。在网络分析中，拓扑特征提供了评估节点角色的指标，高值表示节点在网络中而低值表示外围位置。在本研究中，我们观察到的潜在退化相关分类群的程度中心度、中间中心度和紧密中心度值较高，表明它们比其他分类群更常位于中心生态位置。因此，为潜在的降解相关类群产生了一个更紧密的连接子网络。这一发现可能是因为具有菲降解能力的细菌在受污染的环境中开发了丰富的资源（例如石油碳氢化合物），从而在相互作用网络中形成了优势和广泛的生态位。结果表明，潜在的降解相关类群不仅在有机污染物的降解中起着重要的生态作用，而且在维持细菌类群之间复杂的联系方面也起着重要的生态作用。
图4注：菲降解后富集的细菌类群的分布。（A） 潜在降解相关类群相对丰度与菲降解速率的关系。估计线性最小二乘回归关系。（B） 可耕土壤和石油污染土壤细菌群落中潜在降解相关类群的总体分布（**，p<0.001，Wilcoxon秩和检验）。（C） 豆科植物根际细菌群落中潜在降解相关类群的成对分布，以及可耕土壤和石油污染土壤之间的无植物处理。基于Wilcoxon秩和检验，所有配对组的可耕地和石油污染土壤之间存在显著差异（p<0.001）。
在所有样本中，潜在降解相关类群的相对丰度与菲降解率显著正相关，这是通过线性回归分析确定的（图4A）。此外，与耕地相比，受石油污染土壤中的所有细菌群落都具有更丰富的潜在降解相关类群（图4B和C）。根据它们的分类特性（表S3），潜在的降解相关分类群包括不同的分类群，包括变形菌门、浮霉菌门、氯弯曲菌门、放线菌门和拟杆菌门。使用热图（图5）对分类分布进行了更详细的分析，揭示了不同样本组中与Spearman相关系数>0.45的潜在相关otu。石油污染土壤细菌群落中潜在相关的OTUs分布较多，主要分为Rubellimicrobium、Pseudoxanthomonas、Ohtaekwangia、Algoriphagus、Hydrogenophaga和Bauldia。能够降解石油碳氢化合物等污染物的根际微生物可以被植物组装起来，以促进土壤修复，进而保护其根部免受石油的毒性影响。在这里，我们观察到根际细菌群落在高降解群和低降解群的组成上表现出相当大的差异。受污染土壤细菌群落的组成差异较小，表明污染导致植物-微生物相互作用的特异性降低。来自污染物的干扰将活性微生物类群的数量减少到只有那些耐污染的类群；因此，通常与特定植物物种相关的微生物可能不再是受污染环境中群落的相关组成部分。
图5注：土壤样品中菲降解后富集的细菌类群分类鉴定热图（Spearman相关系数>0.45）。热图中颜色的强度与类群的相对丰度成正比。
图6注：与高或低菲降解率相关的明显细菌模式。基于相对丰度水平大于0.5%的属，比较不同类群对细菌类群负荷的典型判别分析图。箭头表示每个分类单元和每个聚类之间的关联度，作为对每个聚类的预测性判别的度量。圆表示每个类的标准群平均值和95%置信区间。“A low”，低降解率组土壤样本来自耕地；“A-high”，高降解率组土壤样本来自耕地；“C-low”，低降解率组土壤样本来自污染土壤；“C-high”，高降解率组土壤样本来自污染土壤。
我们进一步探讨了石油污染对不同豆科植物根际细菌群落形成的影响，根据菲降解率将细菌群落分为两组。任意地，为了平衡这两个类群之间的样本数量，将菲降解率大于55%的石油污染土壤和菲降解率大于25%的耕地土壤的根际群落划分为高降解类群。两个菌群在可耕土壤和污染土壤中的细菌群落组成均存在显著差异，而在污染土壤中的差异较小。CDA显示了不同类群之间分类关联的差异（图6）。例如，剑菌属、新鞘脂单胞菌和鞘脂单胞菌在可耕和污染土壤的高降解群中都很丰富，而固醇杆菌和盖埃拉菌则与可耕土壤的低降解群有关。污染土壤的低降解菌群中含有丰富的铁矿砂单胞菌和浮霉菌，而中慢生根瘤菌和根瘤菌分别与耕地和污染土壤的高降解菌群有关。不同的分类与不同的根际群落相关。例如，剑菌属、新鞘脂单胞菌属和鞘脂单胞菌属在高退化与污染的根际群落中很丰富。先前的研究表明剑菌属能够降解菲，在豆科植物中进行固氮，溶解无机磷酸盐，产生吲哚乙酸和铁载体，并诱导系统抗性，共同促进植物生长。鞘脂单胞菌中的新鞘脂单胞菌属和鞘脂单胞菌属可产生植物激素（如水杨酸、赤霉素、吲哚-3-乙酸和脱落酸），并诱导系统抗性以促进植物生长。此外，中慢生根瘤菌还与可耕土壤根际群落的高降解集群有关，并已初步从刺槐根瘤中分离得到。
结论
本研究提供了有力的统计证据，揭示了豆科植物根际细菌β-多样性对预测菲降解率的主要贡献。更复杂的细菌群落表现出更高的菲降解能力。长期污染土壤中的细菌群落表现出较高的潜在降解相关类群相对丰度，这可能在有机污染物降解和维持细菌类群间复杂联系方面起着重要的生态作用。污染土壤根际细菌群落结构的较小差异表明，污染可能导致植物-微生物相互作用的特异性降低。研究结果表明，应重视根际共生微生物之间更为多样和复杂的相互作用，以期通过选择最佳的植物微生物群落组合来提高根际修复的效率。
总结
本文通过分析不同的多样性指标，说明β-多样性能较好地预测豆科植物根际细菌的菲降解能力（译者认为在一些微生物作用能力中，用一些现有的指标去进行预测是一大亮点，如果能自己制作科学易懂的数学模型或公式指标进行预测评估将是更大的创新），同时也说明了更复杂的细菌群落表现出更高的菲降解能力，现阶段越来越多的证据证明复杂的网络结构与高多样性的群落结构更能抵御病害、逆境胁迫以及一些促进作用的功能。另外，焦老师的分析与可视化图片有很强的说服能力，文章的很多图片看起来很美观易懂。在实验设计方面，译者认为可以加一株代表性（治理油污的常见植物）非豆科植物在两种土壤中生长并进行与豆科植物的对比分析，可能更能很好的说明豆科植物在降解石油菲能力独特贡献。其中分析过程中对于污染土中根际土壤与未种植土壤中OUT丰度的比较，译者认为很多证据表明在宿主过滤作用驱动下根际土壤中OUT丰度低于空白土壤。
另外，如果能采集到不同年限污染的土壤，再融合进去分析，对于根际微生物修复石油污染中微生物植物互作机制可能会有更加明确的认识。（总结部分仅仅是个人的一些不成熟或者可能不正确的想法，可自行忽略）
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