Microbiome/破译豆科植物根微生物组组成与功能

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题目：Deciphering composition and function of the root microbiome of a legume plant

破译豆科植物根微生物组组成与功能

期刊：Microbiome （2017）

IF：9.2

通讯作者：Klaus Schlaeppi

摘要：

      背景：多种微生物聚居在植物根部，共同发挥着微生物群的作用。早期的研究已经描述了许多植物物种的根微生物群，但是豆科植物的信息很少，尽管它们在包括农业系统在内的许多生态系统中起着关键作用。豆科植物与固氮根瘤菌形成根瘤共生关系，从而向土壤输入大量的天然氮。本文采用非独立培养和独立培养相结合的方法，对豆科植物红三叶草的根微生物进行了描述。为了了解单个微生物组分的功能及其对植物生长的影响，我们开始将根微生物组分单独或联合接种到三叶草根上。

     结果：在整个根范围内，根瘤菌约占根微生物的70%。其他富集的成员包括来自泛菌属、鞘氨醇单胞菌属、新鞘氨醇菌属和嗜糖假单胞菌属的细菌。我们建立了200个细菌分离物的参考库，发现它们对应着大约20%丰富的根微生物群成员。我们开发了一个微型系统来进行简化的植物微生物接种实验。我们观察到，当大量的根微生物组分单独接种时降低了植物的生长，但如果这种黄杆菌与其他根微生物组分联合接种，这种负面影响就会减轻。

      结论：三叶草根微生物群以营养型根瘤菌为主，并富集于可能提供抗病保护的属中。第一次微生物群接种实验表明，个体群落成员可以在不明显致病的情况下进行植物生长抑制活动，而更多样的根群落可以缓解个体成员的植物生长抑制活动。基于特征的参考菌群特性将使未来的微生物群操纵实验能够破译整个微生物群的功能，并阐明驱动观察结果的生物学机制和相互作用。所提出的还原论实验方法为今后对植物根系微生物群进行系统和功能检测提供了无数的机会。

背景与意义

       固氮植物的微生物群，特别是红三叶草等豆类植物，在微生物群研究中很少受到重视。根瘤菌固氮过程微生物的功能如何影响植物，以及整个微生物群落如何影响它们的宿主，人们仍然知之甚少。另外基于核糖体RNA的根微生物群特征的一个局限性是仅提供基于分类的关于其成员功能的间接信息。我们对包括根瘤在内的整个根系进行了采样，去除了根际，并调查了由根面和根内生境组成的整个根系细菌群落。我们采用多步骤方法研究了根微生物组的组成和可培养部分。我们对三叶草根微生物群的特定成员进行了全面的了解，并开发了一个微观系统，在该系统中，我们对从表面消毒种子发芽的三叶进行了多菌株接种试验，并调查了接种对植物生长的诱导效应。

实验设计：

  整体设计如图所示：

图注：根微生物群的特征。我们收集了一块天然的农田土壤，并将其用于三叶草的一系列生长试验。（一） 利用16s rRNA对根样进行测序，研究了根际细菌微生物群的组成。（二） 我们利用相同的根材料进行分离，以探索根细菌微生物群的可培养部分，并组装细菌分离物的参考库存。（三） 随后，我们开发了一个微观系统来探索植物与微生物的相互作用，（四）通过接种从田间土壤中提取的微生物，研究了三叶草根系微生物的组成。（五） 我们进行了微生物群操纵实验，在实验中，我们接种了可培养的、丰富的根微生物群成员，并评估了它们对植物生长的影响。

1.土壤采样（长期农业试验区外的自然试验土壤）

2.人工气候实验与田间试验

两个人工气候室：8×8×8.5cm的盆栽土灌满，每盆中心播15～20粒无菌种子，生长1周后，对发芽的幼苗进行移除，直至每盆留一株。

田间实验：将聚碳酸酯塑料盆（直径30cm，高度20cm）放置在每个地块的中心，并填充试验土壤（均匀化，筛分至2 mm）。塑料环外的其余区域填充有规则的田间土壤。在每一块地中播种一些消毒种子，并覆盖一层薄薄的试验土壤。分别在9周14周采集根内、根面、根瘤（不区分），提取DNA测序。另一部分用于分离。

3. 从气候室以及田间采集的根相关微生物分离，并提取DNA测序。

4. 微观实验

测试植物微生物相互作用的微观系统。（a）盖子上的四个孔中有三个用无菌的、透气的箔覆盖，以便进行空气交换。第四个孔用蒸压泡沫塞堵住，以便在试验期间用注射器和针头给箱子浇水。（b） 微观结构中填充煅烧粘土作为生长的基质。（c）可以支持4种植物 在25天的个试验期内生长。（d） 收获前25天三叶草的自顶向下视图。使用四种菌株单个或者组合进行接种。

实验主要结果与讨论

1.三叶草根的微生物组组成

图1注：样本类型、生长条件和实验解释了土壤和根细菌群落的许多变化。气候室（CC根，CC土）和自然立地生长试验（NS根，NS土）中根和土壤样本加权均匀距离的无约束主坐标分析（PCoA）。

      使用无约束主坐标分析（PCoA）在加权均匀距离上量化了导致样本间差异（ß-多样性）的主要成分，并发现沿轴1的明显分离（解释了总体变化的69.7%），并确认了土壤和根系具有不同微生物群的一般模式（图。2） 是的。轴2解释了15.5%的总体变化，主要是根系而不是土壤样本，我们没有注意到植物是在同一个气候室的土壤中生长还是在田间生长，这表明生长条件对β-多样性的影响可以忽略不计。我们只检测到生长条件对OTU丰富度的显著影响。

图2注:β多样性的差异与分类学的差异有关。加权均匀距离树形图显示根与土壤样本之间的距离。堆积条形图显示了自然地（NS）和气候室（CC）生长条件下土壤样品（棕色线）和根系样品（绿色虚线）中15个最丰富的门的相对丰度。

图3注：三叶草根微生物区系中丰富的根特异性OTUs。a该图报告了在稀有群落（空黑圈）中所有OTUs的根和土壤样品之间的平均相对丰度和log2转换变化。填充红圈表明根样中61个OTUs显著富集（P<0.05，FDR校正）。深红色圆圈表示根中存在15个OTUs（见文本）。b图（用单独的数据点重叠）显示了排序气候室（蓝色三角形）和自然地点（绿色圆圈）中OTU1（豆科根瘤菌）的中位数相对丰度

    我们发现根系相对丰度明显高于土壤样品，共发现61个OTU显著富集于根系样品中（图3），其中15个OTU丰度在所有根系样品中的平均相对丰度至少为0.1%。这15个OTUs占了稀有序列的74.5%，我们称之为“RootOtus”，指的是三叶草根微生物群中丰富的和具有根特异性的成员。RootOtus主要由变形菌（14个OTUs）组成，代表六个不同的目：根瘤菌（6）、鞘氨醇单胞菌（3）、肠杆菌（2）、伯克霍氏菌（1）、栟杆菌（1）和红螺菌（1）。剩余的非变形菌RootOtus属于厚壁菌门，属于互营养单胞菌属。我们注意到一个RootOtus（OTU1，豆科根瘤菌）支配着三叶根微生物群，并解释了变形菌的高流行率。两种生长条件下的样品中，OTU1在35.4%到89.7%之间，占根系群落的73.5%（图3b）。我们证实，OTU1在整个根系群落中的高丰度是由于根瘤中存在根瘤菌，并且我们注意到根瘤中的一些非OTU1序列，这表明额外的非模块细菌多样性。总之，无论植物是在受控条件下还是在田间条件下生长，根细菌群落没有显著差异，因此通过气候室实验验证了我们的方法。三叶草根际微生物组分丰富，根际特异性强，主要由变形菌和根瘤菌组成，约占根际微生物组分的70%。除根瘤菌外，三叶草在其根微生物群中还支持来自泛菌属、鞘氨醇单胞菌属、新鞘氨醇单胞菌属和单胞菌属等的富集otu。对相关文献的回顾表明，这些基因中的一些细菌分离株具有良好的生物学活性。这可能意味着三叶草根微生物群中的互补宿主服务的分配，分别由上述富含根的属和根瘤菌的根瘤菌提供“疾病保护”和“营养供应”。

2. 三叶草根微生物群的分离成员

图4注：三叶菌参考种的分类多样性。a在门一级的分离物集合的分类组成。b在属级分离物的系统发育多样性和分配给每个属的分离物的数量。

        我们从两个气候室试验的三叶草根和自然生长的植物中分离出细菌，并对总共200个培养细菌进行了鉴定。在培养物收集中，以变形菌为主，占78.5%，而放线菌、厚壁菌、拟杆菌分别占8%、8%和5.5%（图4a）。这些分离物被分为34个不同的属（图4b）。变形菌共有19属（157株），包括丰富的假单胞菌（83株）、紫色杆菌属（19株）和寡养单胞菌属（9株）。我们在放线菌门（16个分离株）中发现了7个属，其中微杆菌属（7个）、微球菌属（3个）和小单孢菌属,（2个）有一个以上的代表性分离株。在厚壁菌（16株）中，我们发现了5个不同的属，其中芽孢杆菌（9株）、葡萄球菌（3株）和假单胞菌（2株）最为丰富。最后，我们在拟杆菌中发现了三个属（11个分离株）：黄杆菌（8个）、粘杆菌（2个）和土壤杆菌（1个）。我们将分离的细菌序列以大于97%的序列相似性聚集到三叶草根群落的代表性OTUs序列中，并确定一个细菌分离物是否构成三叶菌群中丰富且富含根的成员。总的来说，在200个分离菌中，181个（90.5%）菌株聚集在34个OTUs的根群落中，而对于19个（8.5%）菌株，我们没有找到匹配的群落成员。所有34个分离的otu都存在于稀有根系群落中（2426个otu），分离率为1.4%（图5）。与丰富的群落成员相比，分离率提高到23.6%，55个丰富的OTUs在所有根样中的平均相对丰度≥0.1%，其中13个能够培养出细菌菌株。我们的结论是，几乎四分之一丰富的根系群落成员可以在培养中获得，我们通过可管理的努力（200株）和直接的微生物技术实现了这一目标。通过与根系群落结构信息的链接，我们对三叶草根微生物组中具有秩和相对丰度的参考菌系进行了表征，从而为今后的微生物群落调控实验提供了一个工具箱。

3.

图5注：参考原生质细菌与根微生物OTUs的定位。上部条形图显示了三叶草根相关细菌群落中2426个otu的相对丰度，其中500个最丰富的otu显示在灰色条带中。深灰色条表明根OTUs最丰富（平均RA>0.1%）。蓝色条表示参考库存中至少存在一个分离物的OTU。下方的倒条形图表示社区概况中OTU的参考库存映射中的分离数量。条形图的阴影与上图相同，以表示每个OTU的相对丰度。用代表性的OTU名称及其序列总数标记圆括号中群落。

      最后，我们开发了微观结构，并评估了它们进行植物-微生物相互作用实验的潜力。最近的微生物群接种实验表明，大约一半的接种细菌菌株从土壤中生长的拟南芥的根中分离出来，要么完全失败，要么在微观条件下无法牢固地定殖宿主植物的根。我们推测，这可能部分是由于微观环境中不同于土壤的物理和化学条件，这些条件对某些分离株不利。因此，我们进行了土壤浸提实验，以预先筛选可能的微观适应细菌菌株。为此，我们对三叶草的根微生物群进行了表征，这些根微生物群是在接种从试验田土壤中提取的各种土壤微生物群之后组装的（在这里作者对实验土壤与浸提物进行了群落分析）。我们定义了根细菌群落，并在微观条件下确定了根上丰富的otu哪些细菌分离物（图5）。

实验菌株

然后，我们进行了微观实验，将三叶草的根微生物群中分离出的细菌株接种到红三叶草中。其目的不是筛选菌株或测试特定功能，而是将我们的所有工具（参考样本、微观结构、群落测序和土壤提取信息）结合起来，验证未来微生物接种实验的总体实验方法。我们组建了一个简化的社区，从参考样本中选择在微观条件下与根上大量OTU相对应的菌株，并属于集合中具有良好代表性的细菌属：黄杆菌（F，KHB002）、一株假单胞菌（P；KHB004）和一株紫色杆菌（J；KHB023）。我们还包括一个微杆菌（M；KHB073），因为这个属在参考文献中有很好的代表性，并且因为我们希望接种的群落广泛反映植物根中丰富的细菌门微生物群（放线菌，拟杆菌，变形菌；）。我们以106cells /mL的密度将这些细菌单独或组合接种到高压灭菌的微观装置中，并种植表面三叶草种子。然后，我们监测了接种简化群落的群落动态，并在三个重复试验中对接种菌对植物生长的影响进行了评分。

图6注：简化三叶草根微生物群落的微观功能分析。在没有接种细菌（nbc无细菌控制）的情况下，用特定菌株（F黄杆菌KHB002、J 紫色杆菌 KHB023、M微杆菌KHB073、P假单胞菌KHB004）或简化群落（FJMP）在微观环境中生长的三叶草。该图报告了3个独立试验（每个试验4个重复）的平均鲜重（n=12；±s.e.m.）和单个数据点。字母在P<0.0 5时差异（T u k e y's HSD）。b接种（输入）和根上25天后简化群落（FJMP）的群落组成。其他otu序列显示为灰色

     25天后，我们收集实验并计数根上接种菌株菌落形成单位。这证实了所选菌株也能在微观人工生长条件下成功定殖根系。我们注意到在一个实验中生物量较其他两个实验低，并且这个实验向我们表明，当使用高度控制的条件时，也需要大量的复制品。关于单个细菌接种对植株的影响，我们发现黄杆菌对三叶草的生长有负面影响，而其他细菌对地上部生物量的产生没有影响（图6a）。细菌的联合应用（FJMP）也没有对生物量产生明显的影响，但减轻了黄杆菌单独生长时的负面影响。我们在接种后和25天后在根上测量了简化群落的组成。用群落定量法无法捕获到微杆菌，我们注意到有一小部分额外的OTU序列可能代表测序错误或污染，或者来自种子内生菌。尽管存在这些限制，分析显示，与接种时相比，其他三个接种的成员在培养25天期间在根上保持相似的比例（图6b）。这一观察结果表明，黄杆菌负面影响的减轻并不是由于该群落成员的竞争优势，而是其负面活动可能已经被简化群落中的其他细菌“缓冲”了。由于我们测量到黄杆菌约占群落的三分之一（图6b），我们排除了这种负生长效应的丧失是由于该细菌被其他接种菌株所超越的可能性。相反，黄杆菌的生长抑制活性可能被一个或多个共同接种的菌株抵消，或者，在简化的群落处理中，它没有达到足够的细胞密度。

       我们无法用群落定量法（图6b）捕获微杆菌菌株，同样的，来自参考样本的7个分离物也没有聚集到整个数据集中的任何OTU。第一个可能的解释是，微杆菌是一种罕见但易于培养的微生物组成员。或者，微杆菌可能是一个丰富的微生物组分，如参考文献中的许多分离物所示，但由于在PCR引物799F的启动位点上观察到不匹配，因此在群落结构中不存在。微观结构的第三种可能解释是，虽然定量显示微杆菌菌株成功地以单联方式定殖植物根系，但在简化的其他测试菌株的群落。未来的实验需要澄清这些可能性，但无论如何，这是一个培养和基于DNA的方法不重叠的例子，并提醒我们，这两种方法都有固有的局限性。虽然人们经常讨论PCR引物偏向于某些细菌类群，但对于分离培养基也是如此，分离培养基通过有利于某些细菌类群的生长而具有特异性。

     参考菌群和微生物微结构为进一步研究植物根系微生物对植物生长的贡献提供了宝贵的资源。下一步将是利用生物测定和基因组测序确定参考菌的功能特性，例如与生物控制或促进植物生长有关的特性。我们预计，定位到同一OTU的不同菌株与寄主植物的相互作用会不同，因此，OTU内细菌功能范围的测试将是下一步的工作。总之，微观实验有无数的机会。例如，三叶草的微生物群可以根据其分类或性状组成或其多样性进行调控，并测试其对植物生长的影响。此外，社区成员之间的相互作用或社区集会的动态可以被更详细地审查。最后，可以研究微生物群在高盐度、养分利用率降低或病原体等胁迫条件下对植物生长的影响。

结论

      我们报道了一个多步骤的方法，结合依赖培养和独立的方法来描述和功能检查三叶草的根微生物组。实验操作微生物群的需要需要参考菌株的储备，我们相信还原论植物微生物群系统将允许对根微生物群的功能进行系统的检查。对根微生物群进行有针对性的进一步研究，有助于开发新的工具，以提高其他农业植物物种的可持续性，并研究微生物群多样性与植物性能之间的关系。

总结

      本文通过非培养与培养的方法对红三叶草的根微生物群落组成与功能进行了探究，明确了一些特定属的聚集，关于本文的还原方法，一个著名的争论就是关于1%培养的问题，现今有许多报道在特定情况下微生物可以被培养，培养组学也是一大热点。本文的亮点在于实验十分连贯培养与非培养相结合，文中微观实验装置与模式图也是可以学习的。同时红三叶草只是豆科植物的一种，豆科植物的独特群落结构与功能也需要我们持续关注。另外，在微观实验中，单菌与组合菌群的差异与相互作用也值得去探究

（总结部分仅仅是个人的一些不成熟或者可能不正确的想法，可自行忽略）

微信号 : lida179438448

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