Environmental Microbiology/风土是种子相关微生物群组装的关键驱动因素
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题目：Terroir is a key driver of seed-associated microbial assemblages
风土是种子相关微生物群组装的关键驱动因素
期刊：Environmental Microbiology（2016）
IF：5.2
通讯作者：Matthieu Barret
这里先解释一下什么叫风土（Terroir）：风土是一个地理空间，它是根据一个人类社区划分的，在其共同历史上，在自然环境和人类因素相互作用的基础上，共享独特的文化特征、专有技术和实践。
摘要
种子与可能影响植物生长和健康的各种微生物组合一起进化。然而，人们对种子相关微生物组合的组成和形成其结构的生态过程知之甚少。在这项工作中，我们通过对两个不同农场收获的5个不同大豆品种的不同微生物组合的宏条形码，监测了寄主基因型和风土对种子微生物群落结构的相对影响。总的来说，几乎没有细菌和真菌的操作分类学单位（otu）在所有的种子样本中被保存。农场对微生物群落结构的显著影响解释了样本间缺乏共享otu，这解释了样本间细菌和真菌多样性差异的12.2%和39.7%。Brittany 70个otu和Luxembourg 88个otu的显著富集导致共发生模式的差异，反映了这种位点特异性效应。相反，微生物组合结构的差异并不是由宿主基因型解释的。总之，这些结果表明，与种子相关的微生物组合是由基于生态位的过程决定的，而风土是这些选择力的关键驱动力。
背景与目的
1.与植物生命特殊阶段（种子际，花等）相关的微生物研究较少。种子相关微生物组合的结构和组合结构的调节器知之甚少。
2. 了解种子微生物群组装过程可能会在种子质量和农业方面产生实际应用。
3. 普通豆类种植面积广，易受到一些种子传播的真菌、细菌和病毒病原体的关注，这些病原体会阻碍植物的健康和发育。因此，种子微生物群对植物健康和适应的影响对这种作物特别重要。
实验设计
两个地点土壤（BZH，LUX）种植的豆连续两年分别收获五个品种的豆（FlC、RdC、RdB、SES、Cal）。
风土差异：两个实验点作物管理、种子收获和收获后清理和分类一致。两个试验点的特点是平均温度和降雨量不同。此外，土壤中钙、氮、钾和磷含量以及pH值的差异。
种子差异：4个种子批由传统品种的农场种子组成，代表了一系列对疾病和气候因素的耐受性，即FlC、RdC、RdB和SES。从Hild Samen GmbH获得的商业品种Cal的种子用作对照。在BZH中获得了15个种子样本，而在LUX中仅收获了12个种子批次，因为品种RdC未能产生足够的种子进行分析。
SSR基因分型与提取DNA：利用11个SSR分子标记对88个大豆品种进行了基因分型，以验证和探讨5个普通大豆品种之间和品种内部存在的遗传多样性。这些植物在温室中从用于进行田间试验的种子批次中生长，并从每株植物中收集了50毫克新鲜叶组织提取DNA。另外提取前面收获种子微生物DNA，种子微生物细菌16srRNA，真菌ITS1。
本研究的主要目的是评估寄主基因型和风土条件对种子微生物群落组成的相对影响。研究了这两种确定性过程对大豆种子相关微生物群落结构的影响。这些种子样本是通过在位于Brittany（BZH）和Luxembourg（Lux）的两个农场中连续两年将5个不同大豆品种（即“Calima”（Cal）、“Flagelet Chevrier”（FlC）、“Rognon de Coq”（RdC）、“Roi des Belges”（RdB）和“Saint Esprit a Oeil Rouge”（SES））的种子批次相乘获得的。
1. 品种内和品种间的遗传多样性
本研究首次利用11个简单序列重复序列分析了5个大豆品种的遗传多样性（SSR）标记进行评估。根据SSR数据分析，分析的个体数适合代表品种的遗传多样性水平。事实上，所有5个品种的SSR等位基因积累曲线都接近于渐近线。
图S2：普通大豆个体遗传多样性的PCoA研究。根据（A）PC1和PC2和（B）PC1和PC3，对88个普通大豆个体的PCoA散点图进行了研究。个体由一个根据其品种着色的单点表示。
计算的遗传距离（GD）矩阵表明，这些品种由不同数量的多基因座基因型组成，即RdC中的16个基因型（88.9%），FlC中的8个基因型（44.4%），Cal中的7个基因型（43.7%），SES和RdB中的5个基因型（27.8%）。在个体水平上，用主坐标分析（PCoA）研究品种间的遗传关系。前两个主轴解释了总变化的70.7%（图S2A），当考虑到第三个主轴时，这一百分比达到86.3%（图S2B）。前两个主坐标清楚地将Cal和SES与所有其他品种分开，而第三个主坐标则是为了更好地将FlC与RdB和RdC分开。
图S3：品种间和品种内遗传多样性热图。热图：（i）品种间平均成对差异数（绿色，矩阵的上半部分），（ii）品种内平均成对差异数（橙色，对角线）和（iii）品种间校正平均成对差异数（蓝色，矩阵的下半部分）。颜色代码对应的图例在右侧。
分子方差分析（AMOVA）结果表明，品种间和品种内遗传多样性均显著，其中品种间遗传多样性比例最大（77.6%对22.4%）。这些结果被品种间成对差异的平均数（PiXY）所证实，它们都具有统计学意义。SES和FlC（PiXY=8.51，P≤0.001）之间以及RdB和SES（PiXY=7.62，P≤0.001）之间的成对差异最大（图S3）。此外，PiX分析结果显示，不同的品种具有不同的品种内多样性水平。PiX在0.62（SES）到3.43（RdC）之间。在一定程度上，RdB、SES、Cal和FlC的表现相似，而RdC的表现更高（图S3）。根据报告结果，所选品种在遗传多样性之间和遗传多样性内部都表现出很大的水平，其中RdC是最具多样性的品种。
2. 采样对种子微生物区系的影响
为了研究同一地点收获的同一大豆品种的种子样本之间的变异程度，我们监测了田间复制品之间细菌和真菌的OTU共享比例。尽管测序深度相对较高（每个样本超过38000个序列），但在现场复制品之间共享的细菌otu数量较低，从所有细菌otu的0.9%到27.9%。由于与某些种子样品相关的细菌组合仅由一到三个丰富的otu组成，因此在种子样品之间观察到的异质性很可能是由于组合中存在显性分类群，从而掩盖了对其他细菌分类群的检测。相比之下，种子相关真菌组合的组成更为均一，在所有田间复制中保存的OTU占27.6-55.9%。由于重复不是通过重新取样一个种子批获得的，而是由在完全复制块中播种的田间试验获得的田间复制品组成，这种异质性可以部分由试验田内的变化来解释。
图S4：细菌与真菌OUT在试验地与品种间的保存。
接下来，我们探索了在不同大豆品种和试验地点保存的otu，在BZH和LUX中分别观察到22个和16个系统地与每个种子批相关的真菌otu（图s4）。此外，根据植物基因型的不同，每个大豆品种由11-20个普遍存在的真菌otu组成（图S4）。总的来说，7个真菌otu在所有地点和品种之间都是保守的，这表明这些otu代表了与普通大豆种子相关的真菌组合的核心成员。这7个OTUs对应于5个子囊菌和2个担子菌。如前所述，用16s rRNA基因序列获得的数据更具易变性。结果表明，1～3个OTU与不同的大豆品种相关，在所有的试验点和品种之间，只有1个OTU与假单胞菌属相关。
3. 实验场地对微生物群落结构的影响
图1: 估计细菌和真菌的多样性。在Brittany（BZH）和Luxembourg（Lux）采集的种子样本中估计了丰富度（OTUs）和多样性（Simpson逆指数）。每个品种的种子样本用不同的颜色线表示，而灰色区域代表分布的估计。采用Kruskal-Wallis单向方差分析法，评估了生产区对丰富度和α-多样性的影响。
通过比较不同处理间的OTUs数目，初步评价了试验地点和大豆品种对细菌和真菌丰富度的影响。根据Kruskal-Wallis检验，试验地点之间和大豆品种之间的细菌丰富度没有显著差异。此外，细菌组合的α-多样性（用辛普森逆指数评估）也不受试验地点和大豆品种的影响（分别为P=0.25和P=0.29）。与BZH相比，LUX位点真菌丰富度和α-真菌组合多样性显著降低（P<0.001和P=0.01，图1），而大豆品种之间没有差异。
图2：与种子相关的微生物主要聚集在实验地点。细菌（A）和真菌OTUs（B）的热图。通过计算Bray-Curtis相异矩阵对种子样本进行聚类。虽然在每一个细菌和真菌的OTU上计算了Bray-Curtis差异矩阵，但在这些图中仅显示相对丰度大于1%的OTU。OTUs也按共现模式聚类。通过分子方差分析（AMOVA）评价了实验地点对微生物群落结构的影响。浅灰色和深灰色分别表示从Bzh和Lux采集的种子样本。
由于真菌丰富度和种子相关真菌组合的α-多样性受实验地点的影响，因此用Bray-Curtis差异性估计样本之间的多样性（也称为β-多样性）。Bray-Curtis差异指数和随后的AMOVA的层次聚类显示，实验地点对细菌结构（P=0.032；图2A）和真菌组合（P<0.001，图2B）有显著影响。相比之下，大豆品种对细菌组合的组成没有显著影响（P=0.64），对真菌组合的组成也没有显著影响（P=0.81）。通过Bray-Curtis差异矩阵上主坐标（CAP）的典型分析，进一步考察了土壤和大豆品种对微生物β-多样性的相对贡献。一方面，CAP分析表明，种子样品中真菌多样性的大部分变异是由土壤引起的（39.7%的变异，P<0.001），而细菌β多样性的12.2%变异是由这个因素引起的（P=0.037）。另一方面，大豆品种不能解释真菌（P=0.80）和细菌（P=0.78）β-多样性的变化。总之，风土是驱动真菌和细菌组合结构的主要因素。
4.大豆种子微生物群的分类组成
由于种子微生物群的结构主要由生产区域的位置决定，我们研究了两个试验点收获的种子微生物群组成的变化。根据16s rRNA基因序列分析，细菌OTUs主要与γ-变形菌相关，BZH和LUX位点的相对丰度分别为91%和79%。到目前为止，假单胞菌是最具代表性的细菌属，BZH和LUX的读数分别为48%和77%。在真菌群落组成上，LUX的种子菌群以子囊菌为主（83%），而子囊菌（59%）与担子菌（37%）的比例在BZH中更为平衡。在属水平上，隐球菌和镰刀菌在BZH中有很好的代表性，而链格孢菌、曲霉菌和镰刀菌常与LUX相关。
接下来，我们研究了不同试验地点和不同品种之间OTUs相对丰度的变化。细菌和真菌OTUs被定义为在一个校正P值<0.001和log2转换≥2的情况下处理中显著富集或耗尽。使用这些标准，我们只检测到实验地点之间细菌和真菌OTUs相对丰度的显著变化。更准确地说，24个细菌主要与芽孢杆菌有关的OUT在BZH富集。相反，34个otu富含LUX。其中7个OTUs与肠杆菌科有关。有趣的是，在从BZH采集的种子样本中也发现了富含酸杆菌和疣状芽胞杆菌的细菌（表S9）。在两个实验地点之间，真菌OTUs的相对丰度也有许多变化，证实了先前观察到的真菌多样性的变化。共有54个和46个真菌OTUs在LUX和BZH中分别显著富集（表S10）。在这些otu中，丝核菌属和镰刀菌属主要与LUX有关，而隐球菌属和一组未分类的otu富含BZH。
5.种子样品相关微生物类群间的相互作用
图3：在微生物组合中观察到的细菌和真菌群落。推断了与BZH（A和C）或Lux（B和D）收获的种子相关的细菌（A和B）和真菌（C和D）OTUs的环境特异性相关网络。利用mortur实现的SparCC算法的稀疏相关性，推导了otu之间的相关性。通过将序列计数除以总库大小来校正非均匀采样的影响。节点对应于otu，连接边表示它们之间的推断相关性。节点颜色代表不同的细菌和真菌分类。使用R包QGRAPH在网络中仅表示伪P值≤0.001的正（橙色）和负（蓝色）相关性。
BZH和LUX种子微生物组合组成的差异可能与微生物群落结构的变化有关。为了预测种子相关组合中的微生物相互作用，我们通过生成具有稀疏关联的环境特定关联网络（SparCC），探索了这些组合实体之间的正关联和负关联。仅考虑与伪P值≤0.001的推断相关性，我们分别确定了与BZH和LUX收获的种子相关的85和48个细菌otu之间的260和132个相关性（图3A和B以及表S11）。从LUX推断的与种子相关的细菌组合在网络中的节点数较低，这可以解释该站点中OTU0001（附属于假单胞菌）的高患病率。事实上，该OTU相对丰度的增加最终导致其它OTU相对丰度的降低，从而导致共生模式的差异。
总的来说，这两个细菌相关网络被分成一个主要模块和一些两到三个OTUs的小簇。每个相关网络的节点度（节点之间的关联数）相当低，细菌otu之间的推断相关性中值为2。BZH细菌网络的最高程度节点（a.k.a hubs）与分类多样的otu相关，包括α-变形菌、β-变形菌、放线菌和拟杆菌（图3A），而LUX细菌相关网络的hubs主要与γ-变形菌（图3B）相关。与细菌网络相比，从BZH（图3C）和LUX（图3D）采集的种子相关真菌组合推断出的相关网络由较少的边和节点组成，表明这些组合的实体之间的交互作用较少。BZH真菌网络的拓扑结构明显不同于其他真菌和细菌网络的拓扑结构，后者具有由2到8个otu组成的多个模块（图3C）。每个环境特异性相关网络的最高程度节点与显著富集于BZH（eurotiomyces和Tremellomycetes）或LUX（Sordariomycetes）的真菌OTUs相关。然而，这些核心与其他节点共享的连接数与细菌网络（BZH和LUX的最大程度分别为5和4）相比是相当低的。
结论
总的来说，目前的研究表明，与种子相关的微生物组合是由基于生态位过程决定的，而风土是这些选择力的关键驱动力。因此，从事小规模本地种子生产的农民似乎不仅保护了传统品种的种子和遗传多样性，而且还保护了特定于其土地的种子相关微生物组合。虽然我们不能得出特定的土壤结合微生物组合对植物健康和适应性的具体影响的结论，但可以推测，这些组合可能在作物对其生产地的局部适应中发挥作用。对种子相关微生物功能特性的进一步研究将进一步深入了解这一作用。
植物与根际微生物生态
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