Genome Biology/前人栽树 后人乘凉
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写在前面：本文很好的阐释了保护性耕作CA免耕NT策略下作物根际微生物组成与功能，说明前茬残根对后来作物根际微生物的重要驱动作用，为免耕NT策略下微生物作用机制提供了理论依据。
题目: The preceding root system drives the composition and function of the rhizosphere microbiome
先前根系统驱动根际微生物组的组成和功能
期刊：Genome Biology
上线时间：2020.4
三年均IF：13.05
通讯作者: Matthew D. Denton
摘要
背景：土壤环境是维持大多数陆地植物生命的主要原因，但我们对土壤中各种微生物群落的重要功能却知之甚少。土壤微生物栖息在腐烂的根系通道，即残根周际中，可能对植物生长和健康至关重要，因为这些通道是新根生长的首选位置。了解残根周际的微生物宏基因组，以及它对农业管理（如轮作和土壤耕作）的反应，对于改善全球粮食生产至关重要。
结果：本研究以作物土壤根际活腐生态位为基础，建立了一个深入的土壤微生物基因图谱。与植物类型相比，残根周际微生物组对根际微生物组的组成和功能的调节更大：小麦和鹰嘴豆根际微生物组在腐烂根（DR）系统存在下是同质的（65-87%相似），但在耕作破坏DR的情况下是异质的（3-24%相似）。当根际微生物与残根周际微生物在DR存在下相互作用时，根际微生物对植物根系分泌物有明显的降解作用，与膜转运蛋白、碳水化合物和氨基酸代谢相关的基因丰富。
结论: 本研究描述了一个优质土壤微生物基因组的多样性和功能能力。结果表明，残根周际微生物在测定根系发育的宏基因组中起着重要作用。通过土壤管理对根系微生物功能进行改良，最终可以控制植物健康、生产力和粮食安全。
背景与意义：
1.耕作、留渣和轮作等作物管理措施是农业生态系统功能的重要组成部分，但在研究根际微生物群落动态时往往被忽视，特别是在免耕或破坏土壤剖面的苗期早期根际微生物群落的建立过程中。鉴于残根周际（前茬腐根周围的土壤）对土壤微生物群落的影响很大，推测早期幼苗根际群落受残根周际微生物群落的影响。
2. 在NT（免耕）系统中，根通道通常被保持。因此，新建立的作物的大部分根系占据了先前建立的根系通道，部分原因是机械阻力较低，通常被归类为“sense-by-growth”机制的一部分。因此，在NT集约种植系统中，与新作物活性根相关的根际微生物群的形成可能在一定程度上取决于残根周际中存在的微生物，但迄今为止，对与这些微生物群相关的详细微生物群结构知之甚少。
3. 早期苗期是植物建立根际和内生微生物群的关键，土壤生境条件、植物根系和土壤微生物群之间存在着动态的相互作用，对植物生长、健康和作物的总体表现有潜在的影响。
4. 在这里，我们的研究使用小麦（Triticum aestivum L.）和鹰嘴豆（Cicer arietinum L.）的幼苗，分别代表谷类和豆类作物，来评估具有不同根系分泌和种植管理（有/无腐烂根）的植物在塑造根际微生物组分方面的相互作用。鹰嘴豆和小麦的根系分泌物不同，因为鹰嘴豆的特点是与小麦相比有大量的有机和氨基酸根系分泌物。在本研究中，我们比较了不同作物根际微生物群在有根和无根情况下的功能和分类结构。我们特别强调了残根周际及其腐烂根在影响谷类和豆类幼苗根际微生物群发育中的作用。
从同一块地采集了完整的含腐烂根土壤芯样（+DR）和代表通过耕作去除腐烂根的重新装填的土壤（-DR）。小麦、鹰嘴豆和未种植的对照在+DR和-DR条件下，在有三个重复的受控环境中生长。采用相同的植物-土壤设计和生长系统，进行了4个微观试验，评价了植物根系发育、根际微生物群落组成、根际代谢和土壤微生物呼吸。
一、田间采土样：见原文。
二、控制实验：
1. 根系发育：实验安排为完全随机设计，包括3个因素（腐烂根：有/无；植物类型：小麦、鹰嘴豆和未种植；以及收获时间）和4个重复。在播种后3、6、8、10和12d各处理的重复试管中收获，以评估根相对于残茬根的发育情况。试验持续时间较短（12天），因为（1）幼苗的活性根更准确地反映了根系分泌物的遗传变异及其与根际微生物群建立的关系，（2）早期收获可以减少不流动养分与腐根的吸收以及不同作物根际微生物群的形成等影响。使用WinRHIZO系统分析。在12天时，当播种小麦幼苗的根长密度与残茬根的根长密度相似时，开始对根通道占有率进行采样。根通道占有率定义为前茬残根沟内新长根数的比例。
2.根际微生物组：根际土壤在12天取样。
3.根系分泌物：测定了无菌与非无菌条件下根系分泌物丰度的变化，以表明根系分泌物的降解受根际微生物活性的影响。
4.土壤微生物呼吸：采用5个无DR和有DR的未种植管进行土壤呼吸研究。
三、鹰嘴豆共生根瘤菌的鉴定：根据控制试验1-4，将同一种鹰嘴豆品种置于3个盆栽中，用去除腐朽残渣的土壤培养4周。每盆收获3个根瘤。
四、大田实验：比较不同种植管理方式下小麦和鹰嘴豆的产量，在同一块农田上，采用免耕免耕和免耕免耕免耕两种腐朽根系管理方式，两种作物（小麦和鹰嘴豆）和9个成对样品的重复，进行了为期2年的田间试验。
实验主要结果：
1. 生态位的物理、化学和生物特性
在每种±DR处理中，小麦或鹰嘴豆植株生长在受控环境中。DR与非DR对照相比，其理化性质是影响根际微生物群落结构和功能的关键因素。
图1: 腐烂根对小麦和鹰嘴豆根土特性的影响。a：在±DR条件下，从小麦和鹰嘴豆根际的无菌和非无菌土壤中采集根系分泌物化合物（RECs），主坐标分析（PCoA）基于26个RECs相对丰度之间的Bray-Curtis距离。主成分1和2解释的方差百分比如括号所示。b：根际微生物对REC的降解。检测到的26个rec被分为3个化学组。误差条是P=0.05时的最小显著性差异（LSD）。C：小麦和鹰嘴豆活根对腐烂根通道的占有率。d：在P<0.05的条件下，用±DR用ANOVA检验对未种植的盆栽进行培养的累积土壤呼吸表明，处理对每个测量时间点的REC降解和土壤修复的影响显著（*），但对根通道占用（ns）不显著。（p<0.05）
基于Bray-Curtis距离的置换多元方差分析（PERMANOVA）检验，研究生态位之间的根系分泌物成分差异（基于26个检测到的根系分泌物）在植物类型、腐烂根（+和-）和灭菌（+和-）之间具有显著的三方交互作用（基于P<0.01）。在灭菌条件下，分离取决于植物类型，而在非灭菌条件下，-DR比+DR的植物类型效应更强（图1a）。这说明腐烂根的存在掩盖了株型对根系分泌物代谢的影响。
表1：植物土壤生态位的化学和生物学特性。测定的性状包括根际土壤pH值、微生物数量、微生物功能和类群的多样性。以OTU和基因为基本单位进行多样性评价。土壤样品的测量是从小麦和鹰嘴豆根际的+和-腐烂根（+和-DR）。同时对-DR的土壤和腐烂根的根际进行了采样。同一行的同一个字母在P<0.05时，基于最小显著性差异（LSD）。
根际根系分泌物降解是通过根分泌物浓度从灭菌状态降低到非灭菌状态来计算的（图1b）。根际微生物在+DR中对根系分泌物的降解作用大于-DR（P<0.01）。在+和-DR条件下，鹰嘴豆根际代谢的根分泌物比小麦多。此外，在活土壤中，与土壤和小麦根际相比，不含DR的鹰嘴豆形成了酸性根际（P<0.05，表1），但在DR的存在下，鹰嘴豆根际pH值与其它根-残根周际生态位无显著差异。
考虑到残根周际对根际的影响，+DR处理的鲜根生长与残根有着密切的联系。对于小麦和鹰嘴豆，大约60-80%的新根遵循先前根残留的通道（图1c）。与-DR盆相比，+DR盆中鲜根与残根通道相互作用密切，根畸变率更高（P<0.01）。
+DR条件下根际细菌数量和活性（累积的CO2-C进化）比-DR条件下高（两倍；P<0.01）（表1和图1d）。在+DR下，只有小麦根际和残根周际处理比-DR含有更多的真菌，而与细菌相比，真菌在微生物群落中所占比例很小，仅占细菌拷贝数的1/100-1/200（表1）。
因此，腐烂根的存在改变了活根的根际代谢、根生长和根生物活性，对植物根际微生物群的形成起着重要作用。
2.生态位之间的微生物分类和功能组成。
图2：小麦和鹰嘴豆根际微生物群在+和-腐烂根（DR）下差异丰富的基因。根据对数2倍变化>1和FDR调整的P值<0.01来定义基因（红点）在土壤中的富集和耗竭。
基于16S rRNA基因的扩增序列和宏基因组测序数据，以未种植的未加腐烂根际土壤为对照，进行了差异丰度分析。我们比较了根际生态位（包括±DR）和土壤中个体组合操作分类单元（otu）、非冗余基因和KOs的丰度差异。根据log2转换>1和FDR调整的P值<0.01，利用3个重复，确定了不同作物类型在±DR条件下根际otu、非冗余基因和KOs的富集和缺失（图2）。
图3：小麦和鹰嘴豆在±DR根际微生物分类和功能结构的比较。a在±DR下，小麦和鹰嘴豆之间的富集otu数量和基因共享。b在±DR条件下，三元图包括了土壤与小麦（WHR）和鹰嘴豆（CPR）根际的所有检测KOs，每个圆表示一个KO。每个圆的大小表示其相对丰度的加权平均值。每一圈的位置由土壤和两种植物根际的贡献决定。绿圈表明小麦根际土壤对KOs的富集程度高于土壤（log2转换>1，FDR调整P<0.01）。洋红色圆圈表示鹰嘴豆根际富集了KOs。青色圈表明小麦根际和鹰嘴豆根际都富集了KOs。
在±DR下比较了小麦和鹰嘴豆根际微生物组的分类和功能基因组成（图3）。结果表明，在+DR条件下生长的小麦和鹰嘴豆根际微生物类群具有高度的分类和功能相似性，而在-DR条件下生长的小麦和鹰嘴豆根际微生物类群的组成和功能存在显著差异。这一结论得到三种不同类型统计分析结果的支持（图3）。首先，当存在腐烂根时，小麦和鹰嘴豆富集的otu和基因有很大的重叠，分别占单独富集小麦和鹰嘴豆的48-77%和65-87%（图3a）。在没有腐烂根的情况下，两种作物所富集的重叠otu和基因数量减少，小麦和鹰嘴豆分别约为5-14%和3-24%（图3a）。植物类型和腐烂根的相互作用同样影响着耗尽otu和基因的结果。
在+DR条件下，小麦和鹰嘴豆对KO和OTU丰度的贡献几乎相等，如三元图中大部分KOs（图3b）和OTU的分布所示，它们远离小麦和鹰嘴豆角。在KEGG数据库中，考虑到在三元图中很难清晰地表达大量的基因，基于它们的功能相似性将基因合并到KOs中，并将KOs作为生成功能三元图的基本单元。在+DR中，5289个KOs中只有9个和16个，超过60%的计数分别来自小麦和鹰嘴豆根际（图3b）。相反，在-DR系统中，植物类型对KOs的丰度有很大的影响：在5289个小麦和鹰嘴豆根际中，由植物根际贡献的60%以上的KOs数量分别为621和256个（图3b）
对OTUs和基因的主坐标分析（PCoA）表明，+DR下的植物处理是紧密分组的，但在-DR下明显分离，特别是在基因组成上。当腐根与株型被限制为两个因素，基于Bray-Curtis距离的PERMANOVA分析表明，腐烂根是变异的主要原因。各因子及其相互作用对基因组成的影响显著（P<0.01），腐根×株型互作对微生物分类结构的影响不显著。+DR下小麦与鹰嘴豆根际生物群的Bray-Curtis距离短于-DR（P<0.01，表1）
除了比较±DR下两种作物的根际微生物群外，我们还研究了残根周际（腐烂根周围的土壤，没有种植活作物）中丰富和耗尽的微生物基因（相对于bulk土壤）。残根周际样品中富集和缺失的基因中，在+DR的小麦或鹰嘴豆根际中观察到44–53%的基因，表明有明显的重叠。与鹰嘴豆根际相比，小麦根际微生物群与残根周际共有大量的富集基因和o t u。
除了取样生态位之间的β多样性差异外，+DR处理下小麦和鹰嘴豆根际的OTUs香农指数和基因等微生物组的α多样性高于-DR处理（P<0.01，表1）。因此，腐烂根的存在及其物理、化学和生物学特性很可能促进了小麦和鹰嘴豆活根中更相似的根际微生物。
3.功能注释
图4：不同生态位间微生物基因群a和分类属b的相对丰度。采样的生态位包括生长在+和-腐烂根（DR）下的鹰嘴豆（CP）和小麦（WH）的根际、从-DR中的未种植对照中采样的bulk土（BS）和从+DR中的未种植对照中的腐烂根周围土壤中采样的碎屑层土（DS），受生态位影响显著（P值经Benjamini-Hochberg-FDR<0.05调整）。
比较了不同根际和土壤中微生物功能和分类科的相对丰度（图4）。应用Benjamini-Hochberg-FDR方法对3个重复样本进行方差分析，以校正后的P<0.05为基础，确定各生态位之间的统计差异。对不同生态位有显著反应且丰度最高的功能和分类群如图4所示。
+DR下的生态位具有相似的基因功能丰度，属于“碳水化合物代谢”、“外源生物降解”和“膜转运”的序列比例高于-DR下的植物根际生态位（调整后P<0.05，图4a）。分配给遗传信息处理的基因，如根际微生物群中的“复制和修复”和“核苷酸代谢”，被-DR根际生物群上调，而不是被+DR上调（经调整P<0.05）。
-DR下，鹰嘴豆和小麦根际微生物群之间存在着类似数量的“碳水化合物代谢”基因，与-DR小麦相比，鹰嘴豆根际具有更丰富的碳水化合物降解功能（糖苷水解酶（GHs））和更少的碳水化合物合成功能（糖基转移酶（GTs））（调整后P<0.05）。此外，-DR鹰嘴豆根际具有最低比例的与“膜转运”和“能量代谢”相关的功能，这与其最低丰度的“主要活性转运蛋白”相关。
富集或缺失基因的数量（相对于土壤）也被标注到不同的功能和分类群中，并且功能基因数量在小生境中的富集与相对丰度分析的结果相匹配。在+DR下与膜转运和碳水化合物降解功能相关的丰富基因，以及植物根际细菌目根瘤菌的数量多于-DR。
4.生态位分类情况
基于16srrna基因扩增子测序的OTU分析表明，两个最丰富的细菌属Kaistobacter和Rubrobacter在没有DR的情况下比DR的情况下更丰富（经校正P<0.05，图4b）。在-DR或+DR下，没有DR的鹰嘴豆根际比其他根际生态位含有更多的芽孢杆菌属。相比之下，有DR的鹰嘴豆根际诺卡氏菌属、纤维素单胞菌属、斯科曼氏球菌属、甲基杆菌属、贫养杆菌和气微菌属的丰度（0.76%）高于无DR的鹰嘴豆根际（0.34%，经校正P<0.05）
当根际生态位的富集基因被注释为分类类群时，与-DR相比，+DR的根际富集基因属于根瘤菌的比例（最丰富的顺序）更高，而根瘤菌目不包括最丰富的属，如Kaistobacter、Rubrobacter与Bacillus。除了分析上述整个基因目录的分类组成外，还评估了涉及特定功能群的基因的分类组成。非冗余8个功能群中的每一个都被用于分类注释。与整个基因目录相比，根瘤菌对‘膜运输’相关功能的贡献更大，鞘氨醇单胞菌对‘转录’和‘能量代谢’的贡献更大。“外源生物降解与代谢”涉及较高比例的未分类变形菌。此外，根据Mantel分析，实验处理，如腐烂的根和植物类型，对微生物组成的影响在顺序水平上在被测试的功能群和整个基因目录中是一致的。
比较16S rRNA基因扩增子测序和宏基因组测序两种微生物组分分析方法。在属水平上，相比于宏基因组对16S rRNA基因进行测序，可以得到更多的定位到已鉴定属的序列。通过宏基因组学方法鉴定的属具有更大的多样性。对于高度丰富的Kaistobacter和Rubrobacter细菌，两种方法的相对丰度显著相关。而对于宏基因组测序相对丰度极低的芽孢杆菌属和嗜地杆菌属，两种方法之间的相关性不显著。
5.鹰嘴豆共生根瘤菌
图5：小麦和鹰嘴豆根际中鹰嘴豆共生根瘤菌的相对丰度。通过对清除根瘤菌16s rRNA基因的分析，鉴定了鹰嘴豆共生根瘤菌OTU（csrOTU）。方差分析结果表明，经Benjamini-Hochberg-FDR校正后，P值显著低于0.05。
在短期土壤微生物实验（实验2）中，由于鹰嘴豆的生长期较短（12天），没有观察到根瘤。用同一品种的鹰嘴豆在同一土壤中进行了4周的实验，并对收获的根瘤组织进行了16S rRNA基因测序。其中一个OTU被鉴定为鹰嘴豆共生根瘤菌（csrOTU），在根瘤序列中占90%以上。通过对根际生态位（实验2）的所有OTU进行爆破，根据csrOTU序列，确认一个OTU为csrOTU。不同生态位的csrOTU分析表明，+DR下的生态位中csrOTU的含量是-DR下的10倍以上（P<0.01）。在+DR范围内（图5），鹰嘴豆根际的csrOTU含量低于小麦根际和残根周际。
6.大田评估
通过两年的田间试验，研究了不同作物类型根际微生物组合和盆栽试验中观察到的腐烂根对作物田间生产性能的影响。在同一土壤中种植小麦和鹰嘴豆，保留和去除小麦的前茬残根。小麦从-DR向+DR过渡的产量增加比鹰嘴豆显著。
7. 活-腐根际生态位土壤微生物基因图谱
通过对所有宏基因组序列的梳理，建立了一个非冗余基因目录，包含19.8 M基因，平均长度513bp，总长度10.16gbp，平均读取39.6%的映射率。非冗余基因目录通过将其与分类和功能数据库对齐进行注释，包括NCBI微生物NR数据库（76%的基因被映射）、KEGG（76%的基因被映射）、eggNOG（70%的基因被映射为NOG+COG）、CAZy（10%的基因被映射）和TCDB（1.6%的基因被映射）。由于稀疏曲线达到饱和，本研究中的测序深度和已建立的基因目录被认为足以覆盖他们查询的数据库。
图6:基于一个集合样本的土壤基因组覆盖率，a测序深度增加时检测到的非冗余基因数量的稀疏曲线。KEGG（b）、eggNOG（C）数据库与分类组(d)中基于用最低共同祖先法建立NCBI微生物NR数据库属于功能群的基因数。
在KEGG数据库中，功能未知的基因所占比例约为5%，而在eggNOG数据库中所占比例更大，约为50%（图6b，c）。与膜转运功能和碳水化合物、氨基酸、DNA和能量代谢相关的基因占已知功能的大多数，KEGG数据库（图6b）中约46%，eggNOG数据库中约32%。
基因目录的分类表明，大约95%的生物属于细菌界（图6d）。在细菌中，有很大一部分（47%）的基因是在一个以上的门（这里定义为“未经确认的”）中检测到的。属于一组非细菌生物（真菌、古细菌和病毒）的基因很小，不到0.4%。
在这项研究中，我们建立了一个长期农业土壤的微生物基因目录。证明了腐根形成的残根周际在决定根际微生物群落结构和潜在功能中的重要作用。腐烂根的存在使不同作物的根际微生物群均匀化，通过腐烂根与细活根的紧密接触，形成一种降解植物根系分泌物的活性微生物群。这些结果表明，在保护性农业系统中，残根周际和根际等微生物处于不断的相互作用中，提供了受作物类型和系统物理化学性质调节的微生物热点。
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