ISME/苯并噁唑嗪酮对玉米根微生物组的调控
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题目：Metabolic regulation of the maize rhizobiome by benzoxazinoids苯并噁唑嗪酮对玉米根生物群的调控
期刊：ISME(2019)
三年均IF：9.559
第一作者：T. E. Anne Cotton
通讯作者：Stephen A. Rolfe &Jurriaan Ton
摘要
根生物群落是植物生长和健康的重要调节因子。植物通过初级和次级根代谢产物的产生和释放来塑造其根生物群落。苯并噁唑嗪酮（BXs）是禾本科植物中常见的色氨酸次生代谢产物，调节地下和地上生物相互作用。除了生物杀灭活性外，BXs还可以作为信息化学物质或植物防御信号调节植物与生物的相互作用。然而，BXs形成根相关微生物群的完整程度和机制仍有待于深入研究。在这里，我们采取了一个全局性的方法来检测BXs对玉米根代谢组和相关细菌和真菌群落的调节活性。采用非靶向质谱分析结合原核和真菌扩增子测序，我们比较了三种基因突变在BX途径不同步骤中的影响。我们发现，BXs调节整体根系代谢，同时以根系类型依赖的方式影响根生物群。BX控制的根系代谢物与细菌类群的相关性分析表明，BX依赖的代谢物，特别是黄酮类化合物，在抑制一系列土壤微生物类群，同时刺激亲甲基细菌方面起主导作用。我们的研究支持一个多边模型，BXs通过根次生代谢的整体调节功能控制根-微生物的相互作用。
背景与意义
1. 研究表明，影响根化学的突变改变了根际细菌群落。然而，驱动这些效应的确切遗传和生化机制仍不清楚。因此，阐明根际生物群落的遗传控制是一个重要的研究目标。
2. BXs是色氨酸衍生的苯甲酸类杂环芳烃代谢物，由禾本科植物的根大量产生，包括谷类作物玉米、小麦和黑麦。BX是地下植物-微生物相互作用的重要调节因子，其作用因根系类型而异。大多数关于BXs对植物-生物相互作用影响的研究都集中在单个生物体上，很少考虑不同的根组织。因此，BXs对复杂根际生物群落的广泛影响还不清楚。
3. BX代谢产物在玉米-生物相互作用中信号作用的支持来自于BX代谢物2,4-二羟基-7-甲氧基-1,4-苯并恶嗪-3-酮（DIMBOA）可作为细胞壁防御真菌和蚜虫的凋亡信号。迄今为止，很少有研究探讨单株基因突变对根相关微生物群落的影响，而且这些研究都没有描述根代谢相关变化。
4. 本文分析了bx突变对玉米根系代谢和根系相关细菌和真菌根生物群落的影响。采用非靶向质谱分析结合rRNA基因和内部转录间隔区（ITS）测序，比较了BX生物合成途径不同步骤（bx1、bx2和bx6）中3种突变的影响；图1a），建立Bx调控的根代谢产物与BxD依赖根际微生物群之间的关系。
图1：三个独立Bx基因突变对Bx产生的影响。玉米中BX的产生和降解途径。a编码BX生物合成酶的基因名称以蓝色显示。在这项研究中研究的基因用下划线字母字体标记。B，c不同玉米基因型和组织类型中DIBOA和DIMBOA的浓度。数据表示平均值（±SE；n=6）
实验设计
以W22玉米为试材进行试验和Bx1、Bx2和Bx6中W22的Ds转座插入线。消毒后的种子被预发芽，并种植在农业土壤：蒸压珍珠岩3:1（v:v）17天收集根材料。①冠根与初根的代谢物提取。②提取DNA，以16srRNA基因和ITS2序列为靶点，对根和土壤样品中的细菌和真菌微生物群落进行了描述。定量PCR（qPCR）技术，比较野生型和突变型植株的细菌和真菌DNA总量。
在相关性分析时值得一提的是：由于代谢组和微生物组分析是破坏性的，所以不可能直接比较相同的样本。因此，数据集随机配对100次，并计算从DESeq2广义线性模型获得的方差稳定值之间的平均Spearman相关。由于很少有真菌受到bx突变的影响,此步不包括真菌分析。
主要结果
1. Bx基因型对植物生长表型及根系Bx谱的影响。
为了排除bx突变对根系代谢产物和相关微生物群的间接发育影响，比较了WT和bx突变株芽和不同根型的生长表型和干重。所有的系在形态上相似，发育出相似的生物量，并且在分析时具有相似的根系分布，表明bx突变对生长发育没有显著影响。根BXs的定量主要集中在2,4-二羟基-1,4-苯并恶嗪-3-酮（DIBOA）和DIMBOA的苷元上，因为它们比相应的糖苷更稳定可靠。与WT相比，bx1和bx2突变体的冠根和初生根中DIBOA和DIMBOA的浓度显著降低（图1b和c）。这与BX途径前两个专门步骤中Bx1和Bx2的酶功能一致（图1a）。与WT植物相比，bx6突变体的根具有增加的DIBOA浓度和降低的DIMBOA浓度（图1b和c），这与bx6在DIBOA多步转化为DIMBOA过程中的DIBOA糖苷双加氧酶活性一致（图1a）。然而，正如先前关于该突变体中芽BX水平的报道，bx6突变体的影响是部分的：与WT相比，bx6的初生根和冠根的DIMBOA浓度分别仅降低62%和55%。因此，bx6突变对BX生物合成的影响相对较弱，仅部分阻断了二苯甲酸的生产，而对总BX浓度没有主要影响。
2. Bx基因型对根系代谢的影响
图2：野生型（WT）和bx突变体冠根和初生根代谢离子（正负）的主成分分析（PCA）。椭圆表示置信区间（n=6）。
BXs可以通过其作为植物防御信号化合物的活性间接影响植物-生物的相互作用。因此，Bx1、Bx2和Bx6的突变可能影响比BXs更广泛的根系代谢产物，而BXs反过来又可能影响根生物群落的组成。为了研究三种bx基因突变对更宽根代谢谱的影响，我们采用UPLC-Q-TOF质谱分析了冠根和初生根甲醇提取物。该非靶向分析确定了所有组织/基因型组合（6411 ESI-和16457 ESI+）之间共有的22868个离子。所有离子的无监督主成分分析表明，根系类型和基因型对玉米根系的代谢产物谱有重要影响（图2）。成分1解释了14.2%的数据变化，主要是从冠根和初生根中分离的样本，这对于WT和bx6植物比bx1和bx2植物更为明显。成分2解释了9.7%的变异，将WT和bx6样本从bx1和bx2样本中分离出来，这与我们发现的bx1和bx2突变对总BX产生的影响相似，而bx6突变对根BX组成的影响相对较小（图1b和c）。代谢物样本的统计分析证实了根型、基因型和根型×基因型相互作用的显著影响，这共同解释了43%的数据变化。假设离子丰度的对数正态分布，使用广义线性模型来识别不同样品之间的代谢物。总之，WT和bx根的非靶向代谢谱显示bx1和bx2突变对根代谢谱有重要影响，表明BXs在玉米根系代谢调控和分化中的全局作用。
3.根系和Bx基因型对土壤细菌和真菌群落的影响
为了研究玉米根系、根系类型和Bx基因型对微生物群落的影响，从根际土壤覆盖冠层、初生根和无植株土壤中提取DNA。qPCR法定量分析细菌16s rRNA基因及真菌ITS区域显示野生型和突变型植物样品的统计无显著性差异，说明Bx基因型和根组织对微生物总生物量没有影响。
为了研究根型和Bx基因型是否改变了微生物组分，对细菌16srRNA基因和真菌ITS2区进行了扩增并进行了Illumina测序。在质量控制和嵌合体去除后，细菌数据集由8740090个16srRNA基因序列组成，去除引物后的平均序列长度为377bp，每个样本52176-234324个序列。真菌数据集由9722174个ITS序列组成，去除引物后的修剪序列长度为130 bp，每个样本包含45382-280805个序列。序列分为41449个细菌OTUs和21981个真菌OTUs。稀疏分析表明，足够的测序深度可以捕获所有样本中细菌和真菌的大多数otu。优势菌门包括变形菌（43.4%）和放线菌（29.0%）。在纲水平上，细菌OTUs包括β-变形菌（18.3%）、放线菌（15.5%）和α-变形菌（13.1%），它们通常与土壤或植物根相关。在所有样本中，没有一种细菌的OTU相对丰度超过2%。相比之下，真菌群落主要由一个OTU（Purpureocil lium lilacinum ，syn:paecillomyces lilacinus）主导，在所有样本中其相对丰度在49.9%到66.1%之间。
在所有细菌和大多数真菌分析中，根样中微生物丰富度、逆辛普森多样性和香农多样性的稀薄测量值明显低于无植物土壤样品。这种根际微生物多样性的减少以前已经报道过，这可以归因于更适合根际环境招募专门分类群。此外，对于所有测试的基因型，冠根相关群落的多样性指标明显低于初始根相关群落。丰富度和多样性指标均未显示bx突变株与WT株之间存在显著差异（数据未显示），表明bx基因对玉米根微生物多样性没有显著影响。采用主坐标分析法（PCoA）研究了微生物群落结构的整体差异。对数据进行过滤以去除低丰度otu，生成由3030个细菌和545个真菌otu组成的简化数据集。细菌OTUs在加权均匀距离上的PCoA将无植物土壤样品与根+根际样品（组分1和2）分离。此外，PCoA从初生根和冠根（成分2和3）分离样本，但未能从不同bx基因型分离样本。真菌OTUs的PCoA，使用加权Bray距离，没有导致按样本类型分离。PERMANOVA发现根+根际样品的细菌群落与无植物对照土壤的细菌群落有显著差异（P=0.001）。在根+根际样品中，根型（P=0.002）影响显著，植物基因型（P=0.103）无显著影响，根型与植物基因型之间存在显著交互作用（P=0.019）。尽管真菌OTUs的差异不太明显，但PERMANOVA分析显示，来自无植物土壤和各种根+根际组合的样本之间存在统计学上的显著差异（P=0.001）。此外，根型对真菌OTU分布的影响具有统计学意义（P=0.010），但基因型没有影响（P=0.121），两者之间也没有统计学意义上的相互作用（P=0.440）。总的来说，OTU多样性和组成的分析表明根的存在和根的类型比Bx基因型对微生物群落的影响更大。
4.Bx基因型对细菌和真菌类群的影响
使用一个广义线性模型，假设OTU呈负二项分布，并在较低的OTU丰度下校正增加的方差，从而识别出不同样品之间的细菌和真菌OTU。与无植株土壤相比，545个细菌OTUs在根+根际样品中富集，而602个OTUs在一种或多种根样品中缺失。在真菌OTUs中，只有61个在统计上富集，42个在统计上耗尽了一种或多种根+根际样品。因此，玉米根系对细菌OTUs的影响比真菌OTUs大。根富集细菌OTUs包括在根际环境中常见的α-变形菌、β-变形菌、γ-变形菌和黄杆菌。
图3：WT和bx突变体植物根系中细菌（a）和真菌（b）操作分类单位（OTUs）的差异。左边的热图投影代表了bx突变体和WT（冠根和初生根）之间相对OTU丰度的Log2倍变化。仅显示统计显著值（p≤0.05）。红色表示Bx促进的otu在WT中的丰度比Bx突变体高；蓝色表示Bx抑制的otu在Bx突变体中的丰度比WT中的丰度高。注意细菌和真菌otu之间的比例差异。系统发育在分类群的顺序层次上，其代表性超过两次。右侧的韦恩图显示了bx突变体和WT根（冠根和初生根）在相对丰度上存在统计差异的独特和重叠的OTU数量。“up”和“down”是指bx突变体相对于野生型的丰度。
为了消除根系类型的混杂效应，分别对初生根和冠根进行了植物基因型间根+根际样品的统计比较。我们鉴定了总共113个细菌和21个真菌OTUs，这些OTUs通过至少一个bx突变在冠根和初生根中发生了统计学上的改变（图3）。在这个选择中，bx1和bx2突变对OTU丰度的影响比bx6大。在冠根中，bx1和bx2突变体分别改变了89和33个细菌OTUs，其中22个在两个突变体基因型之间共享。在初生根中，只有12个和24个细菌OTUs分别受到bx1和bx2突变的影响，其中9个在两个突变之间共享（图3a）。在冠根中，Bx1依赖和Bx2依赖的otu分别占数据集中序列读取的10.3%和4.1%；在初生根中，Bx1依赖和Bx2依赖的otu分别占数据集中序列读取的14.8%和4.5%。因此，Bx1和Bx2基因在细菌类群数量方面对冠根的影响大于对初生根的影响，但两种根类型之间的相对丰度是可比的。一般来说，变形菌菌（特别是β-变形菌）的成员对bx突变（刺激或抑制）有反应。此外，疣状芽胞杆菌和拟杆菌有利于bx突变体的生根，而厚壁菌和放线菌有利于WT植物的生根。
与细菌otu相比，较少的真菌otu在WT和bx突变体之间的丰度表现出统计学上的显著差异（图3b）。冠根中大多数Bx反应真菌OTUs（14）受bx1突变的影响。尽管Bx依赖的otu数量相对较少，但它们的差异倍数通常高于细菌otu。Agaricomycetes与Sordariomycetes(Family Lasiosphaeriaceae)的成员尤其受到bx突变的强烈影响。Bx依赖的真菌OTU包括土传病原菌，如圆孢斜丝酵母菌（gaeumanomyces cylindrosporus，poacae的一种病原菌，小麦全蚀病的病原菌gaeumanomyces graminis var.tritici的一个近亲），以及根腐病的病原菌（Ilyonectria macrodidyma）。
5. Bx依赖性根系化学与根系微生物群的关系
根的UPLC-Q-TOF分析揭示了bx突变对根代谢的整体影响（图2）。因此，Bx生物合成基因可能通过Bx控制的代谢产物间接影响根相关细菌OTUs的丰度。为了解决这一假设，我们对来自冠根和初生根样本的所有Bx依赖性细菌OTU和Bx依赖性代谢物离子进行了多重相关分析。通过选择系数≥0.5的正相关和负相关，该分析确定了四种不同类型的OTU-代谢物关联：（i）在WT中含量更丰富且与根代谢物正相关的OTU；（ii）在WT中含量更丰富且与根代谢物负相关的OTU；（iii）在bx突变体中更丰富的OTUs与根代谢产物正相关，（iv）在bx突变体中更丰富的OTUs与根代谢产物负相关。
图4：方差稳定相对OTU丰度与代谢物离子之间的Spearman相关性。只有≥0.5的相关性出现（正相关性：蓝色；负相关性：红色）。受Bx刺激的otu（相对于Bx突变体，在WT中富集）形成一个簇（1）。Bx抑制的OTU（富含Bx突变体，相对WT）形成三个簇（2-4）。饼图显示了推测代谢物在每个簇的不同代谢物途径/类别之间的分布。
我们鉴定了8个BX刺激的OTU，与bx1/2突变根相比，它们在野生根中富集（图4，簇1）。这些OTU与545种代谢物呈正相关（关联i），与78种代谢物呈负相关（关联ii；图4）。三个OTU的相关性最强，都对应于嗜甲基菌科的成员，它们可以使用甲醇或甲胺作为唯一的碳源。其余5个otu的相关性较弱，其中2个属于亚硝化单胞菌科，1个分别属于草酸杆菌科、互营养杆菌科和盖氏菌科。表S8列出了与1类OTU相关的代谢物的假定特性。正如预期的非靶向代谢分析，假设的分配只能对大约50%的离子进行。Bx促进的OTUs与WT和Bx突变根的代谢物呈正相关，与BXs表现强烈一致。然而，与其他代谢物的正相关也很普遍。最丰富的代谢物种类是黄酮类化合物，其贡献超过一半的代谢物与Bx刺激的OTUs正相关。考虑到黄酮类化合物可以作为有益土壤细菌的补充信号，这一结果支持了我们的假设，即Bx基因对这些细菌otu的刺激作用在某种程度上可以由Bx控制的植物代谢产物介导，而不是BXs本身。
除了8个BX刺激的OTU外，我们还鉴定了43个BX抑制的OTU，与野生型相比，这些OTU富含BX突变根（图4）。这些BX抑制的OTU与296种代谢物呈正相关（关联iii），与1889种代谢物呈负相关（关联iv）。所有这些相关性都与三个不同的OTU簇相关（图4；簇2-4）。最大的簇（4）与代谢物呈负相关。这一类群包括黄单胞菌科（包括植物病原体的一个类群）的成员，Adhaeribacter sp（在细胞吞噬科内，可利用纤维素作为生长基质并粘附于表面），噬几丁质菌科（可利用几丁质）的一个成员，OPB56，SC-I-84和SJA-28 sp。与这些otu呈负相关的假定代谢物包括BXs、类黄酮、脂质和核苷酸（图4）。一个相似但反应较弱的负相关聚类（2）包含四个Ellin517，2个Pedosphaerales sp.成员和一个Hyphomicrobiaceae。最后一个簇（3）包含4个otu，由微球菌科的成员控制。有趣的是，这个簇内的相关性基本上反映了簇1的相关性，这表明有利于嗜甲基菌科的条件抑制了微球菌科，反之亦然。
结论
通过研究BX生物合成途径中的独立突变对根系代谢和微生物群落的影响，我们对影响玉米根生物群落的因素产生了新的见解。结果表明，Bx基因的作用因根型和根在途径中的位置而异，对细菌和真菌群落有不同程度的影响。此外，我们还提供了可信的证据，证明Bx基因通过内源调节活性对植物根信号（包括类黄酮）的广谱性产生影响。因此，我们的研究支持了越来越多的观点，即BXs是地下植物-生物相互作用中重要的信号分子。此外，本文提出的实验策略为研究根际生物群落对植物生长的影响提供了新的假设和工具.
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