Environmental Microbiology/植物发育过程中根际微生物群落功能多样性与病原菌侵染抗性的建立

点击蓝字

关注我们

##

写在前面：将根际微生物-病原菌的相互作用与微生物生活史策略联系起来，在群

落水平基于性状验证功能多样性对抵御病原菌抗性的重要作用。

题目：Rhizosphere microbiome functional diversity and pathogen invasion resistance

build up during plant development

植物发育过程中根际微生物群落功能多样性与病原菌侵染抗性的建立

期刊:Environmental Microbiology

上线时间：2020.5

三年均IF：5.172

通讯作者：韦中

摘要

       根际微生物对植物生长和健康至关重要，许多研究试图将微生物功能与物种和性状组成联系起来。然而，至今很少了解形成群落组成的实际生态过程，使控制微生物群落功能的尝试复杂化。在这里，我们评估了在植物发育过程中出现的微生物生活史和群落级物种相互作用模式。最重要的是，我们使用微生物表型来实验测试与微生物群性能相关的生态位互补性和生活史性状的发展。我们发现根际微生物群从具有随机资源重叠的物种的先锋群落聚集到在后期高密度、功能互补的顶极群落。在植物生长过程中，快速生长的物种进一步被耐毒和耐胁迫的物种所取代。利用从不同植物生长阶段分离出来的合成菌群，我们证明了“顶峰”微生物群的高功能多样性可以更好地抵抗细菌病原体的入侵。通过证明不同的生活史策略在不同的植物生长阶段占主导地位，以及群落水平的过程可能取代单一物种的重要性，我们提供了一个新的工具箱来理解微生物群落的装配并在群落水平上指导其功能。

背景

      1.   了解导致微生物群保持植物健康的参数对于恢复这种功能至关重要。最近的研究表明，微生物组的功能性，特别是对病原体入侵的抵抗力，可能来自物种之间的相互作用，而不是某一特定性状或物种的存在。从“抗性基因”到“群落水平”的转变，有可能对我们理解和引导微生物群装配的能力产生深远影响。

     2.   将植物生长过程中的根际微生物组成熟作为一个模型系统，特别关注物种生活史策略的变化和共生微生物之间的生态相互作用，作为持续过程的指标。

    3.   植物根系在萌发时可以看作是一个先锋生态系统。由于先锋生态系统的低竞争，我们预计这些早期殖民者主要是r-策略者，以低效率的资源使用和有限的承受压力的能力为代价，将资源投资于快速增长的速度。随着时间的推移根际环境的成熟，更多的微生物物种到达根部，我们预计早期的殖民者将被生长缓慢的K-策略者所取代，他们能够更彻底地利用资源，更好地抵抗竞争对手造成的生物压力，并将更多的资源投入到竞争对手的抑制中。此外，我们预计随着时间的推移，竞争互动将变得更加结构化。虽然在幼根中，群落组成可能主要由随机因素驱动，但在后期预期更激烈的竞争意味着占据密切相关生态位的物种可能是互斥的。因此，我们预计共生物种的资源利用模式将在幼根上重叠，但在成熟群落中将变得更加结构化和互补。这将导致整个微生物组在生长后期具有更高的功能多样性，生态演替也可能导致根际群落的入侵。（关于生活史策略详见---ISME/气候变化下定义基于特征的微生物策略及其对土壤碳循环的影响）

      4.   假设：1.在根际生态系统成熟过程中，细菌密度将增加；2.快速生长的物种将被更耐胁迫的顶极物种所取代；3.在根际成熟过程中，共生物种之间的生态位互补性将增加；4.来自成熟根系的群落将更多对病原侵染的抗性高于从幼苗中获得的。

实验设计

1.   采集土壤混匀后用于盆栽试验，表面灭菌后水琼脂发芽3天转移到育苗基质12天后移入盆栽。在移栽后0天（土壤）、5天（营养或苗期）、35天（开花期）和60天（结果期）对番茄植株进行破坏性取样根际土。在每个生长阶段取样3株。提取DNA进行16srRNA基因序列分析+qPCR密度。

 2.   细菌分离鉴定

从土壤和根际土壤中分离细菌在 TSA琼脂板上，同16srRNA基因序列鉴定，将fastree在iTOL中进行可视化。将分离细菌与OTUs的匹配。

3.   分离菌碳资源利用模式：评估37种代表番茄根系分泌物的不同碳源上所有384株细菌的资源利用模式。基于定量底物利用指标的功能多样性表征群落水平资源利用能力。

4.   菌株非生物抗性试验

评估了在有限的资源供应、氧化胁迫和高盐胁迫下，每一株菌株的生长能力，以此作为它们应对次优生长条件的潜力指标。（10%的TSB培养基作为有限的资源供应，完全的TSB培养基以1 mM H2O2作为氧化胁迫，完全的TSB培养基以200 mM NaCl作为高盐胁迫）。

5.拮抗次级代谢产物的产生

我们通过测试不同分离物的清液对Ralstonia solanacearum QL-Rs1115的抑制潜力。

6.重组菌株的病原入侵抗性

我们从每株植物中分离出的32株细菌中重组合成菌群（没有找到补充材料，不清楚如何组合），使它们受到青枯菌的入侵。

实验主要结果

1.   细菌群落密度、多样性和结构的动态

图1：用非培养DNA序列测定番茄不同生长阶段土壤和根际细菌群落组成的动态。A用qPCR测定每克根际土壤16srRNA基因丰度。B：推断的微生物群多样性，以观察到的OTU的丰度来衡量，每个样本的读数超过10次。C组：主成分分析法（PCA）可视化的群落结构。D：植物发育过程中主要细菌相对丰度的变化。每个门都以不同的颜色显示。E：显示植物发育阶段之间唯一和共享OTU数量的维恩图。

      可以看出细菌总密度随时间增加，根系细菌多样性总体上低于根外土壤，植物生长发育对根际微生物群落的丰富度、多样性和结构都有很大的影响。10个最丰富根际细菌门的相对丰度在根外土壤和根际土壤中差异显著。

2.  分离菌株特性

图2：番茄根际土壤不同生长阶段可培养细菌的分类及功能多样性。A：所有分离株的系统发育树。第一条表示从中提取分离物的植物生长阶段，第二条表示每个分离物的属级隶属关系（列出十个最丰富的属）。第三条表明了所有分离物的门级隶属关系。B：由16srRNA基因序列确定的各生长阶段各分离株的门级分类隶属关系。C：菌株与16srRNA基因数据的匹配。上面的条形图代表了所有样本中7938个otu的相对丰度，800个最丰富的otu以深灰色突出显示。（相对丰度>0.1%）。蓝条表示可以与至少一个栽培分离物相匹配的OTUs，下面的倒条形图表示给定OTU匹配的分离细菌数，绿色虚线矩形内的条突出显示与稀有otu匹配的OTUs。

      从不同生长期番茄根际分离细菌，共鉴定出331株，每生长期约90株。细菌分离物属于四个不同的门（变形菌、厚壁菌、拟杆菌和放线菌），反映了这些门在土壤和根际环境中的丰富程度（图2A和2B）。在331株分离细菌中，298株（90.0%）与Illumina测序所观察到的60个OTU相匹配（图2C），只有33株（10.0%）不能与具有代表性的根际微生物序列相匹配。匹配的OTUs覆盖了丰富和稀有的物种。

3. 细菌群落功能多样性与抗逆反应的生活史策略转变。

图3：番茄植株发育过程中根系相关细菌生活史策略的变化。A：不同生长阶段可培养细菌的功能多样性（FD）。FD的定义是基于代表性植物源碳源上的单个菌株的资源利用模式，为每个植物和时间点（每个植物和时间点32个菌落）独立计算。B-D：番茄根系不同生长阶段细菌对非生物胁迫的抗性。抗逆性定义为各分离物在液体介质中的相对生长。评估了三种应激源：低资源利用率（培养基浓度降低10倍）、氧化应激（1 mM H2O2）或高盐度（200 mM NaCl）。一点代表一个分离菌。

      根据植物分离物的资源利用模式，在植物发育过程中，可培养细菌群落的功能多样性（FD）增加花期最高，果实期下降。从植物生长的花果期分离到的细菌对非生物胁迫的耐受性高于土壤和苗期。从果期根际土壤中分离的细菌对低营养有效性的处理效果最好，而从开花期根际样品中分离的细菌具有最高的氧化和盐胁迫耐受性。

4.与青枯菌的拮抗

图4：番茄根际细菌培养上清液在不同生长阶段的抑菌活性。A：上清液对土壤细菌病原菌青枯菌进行了检测，其抑制作用定义为与对照相比病原菌生长减少。每一点显示一个细菌分离物。B：每个分析样品的变异系数。高 变异系数（CV）表明同一株植物中同时存在的不同菌株的拮抗活性不同，低CV表示来自同一个植物的受试菌株具有相同的策略。每一点代表一种植物的变异系数。

      从根际分离的所有细菌，以及大部分从土壤中分离的细菌，对土传细菌病原菌R.solanacearum都表现出一定程度的拮抗作用。平均毒性随生育期而增加，结果期最高。γ-变形菌表现出最高水平的拮抗作用。对筛选出的菌株的拮抗活性观察到高水平的变异。这种异质性在根外土壤中最为明显，在苗期变异弱，并随着随后的植物发育而进一步增加。不同性状变异系数随植物发育的增加而增加，说明幼龄植物可能有利于一般物种投入相对较少的能量生产有毒次生代谢物的条件，而在后期，各种生活史策略可能共存。

5. 微生物群对茄青枯病菌的入侵抗性。

图5：重组菌群的群落水平病原抑制能力。从一个植物样本中分离出的32个细菌分离物中的每一个植物样本在液体培养基中被细菌病原菌青枯菌侵染而重新组装的联合体。病原抑制是指在实验结束时，当病原菌与重组联合体共同培养时，病原菌密度相对于分离培养时的密度的降低。每个点代表一个重新组装的群体。

表1:方差分析表显示重组菌群对细菌病原菌Ralstonia solanacearum侵染的抗性是分类多样性、功能多样性、生活史策略稳定性和平均拮抗活性的函数。分类多样性是在属级细菌鉴定的基础上计算的。根据细菌碳源利用能力计算功能多样性。胁迫下的稳定性定义为三种不同胁迫（养分有效性降低、氧化胁迫和高盐胁迫）下细菌群落生长变异系数的平均值。拮抗竞争能力定义为细菌上清液对病原菌的抑制。显著性结果（p<0.05）以粗体显示。

      与对照组相比，所有重组的联合体都能抑制病原菌的生长，尽管这种影响的程度与联合体的生长阶段不同。花期番茄根际分离的细菌中重组出的菌群对病原菌的抑制作用最强。由于花果期群落也表现出较高的分类学多样性、功能多样性、抗逆性和对病原菌的毒性，因此我们利用这四个参数来检验是否可以预测病原菌的联合抑制。我们发现，根据资源利用率计算出的每个联合体的功能多样性是水平病原体抑制的最佳预测因子（表1）。相比之下，分类多样性、抗逆性的变异性（功能多样性的另一个组成部分）和单个物种的平均抑制活性只是病原体抑制的弱预测因子（表1）。这表明，与通常的假设相反，抗性可能主要是由资源竞争而不是对抗所驱动的。

结论

      我们证明了在植物发育过程中微生物群的形成过程中生活史策略的快速转变，这一现象不能从基于DNA普查方法的纯粹检查中得到。我们认为探讨物种之间的竞争性和促进性相互作用可能代表和解释微生物更替和群落成熟的机制，而无需假定寄主植物的积极指导。

扫描二维码

关注我们