SBB/植物接种中益生菌性状的效率取决于环境约束
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题目：Efficiency of probiotic traits in plant inoculation is determined by environmental
Constrains
植物接种中益生菌性状的效率取决于环境约束
期刊：Soil Biology and Biochemistry
三年均IF：5.024
上线时间：2020.6
通讯作者：Luciane Maria Pereira Passaglia
亮点
1. 功能性状成功预测细菌促植物生长效果。
2. 微生物接种效率具有多样性依赖性，低多样性条件下影响较大。
3. 微生物产生的植物激素与养分的溶解呈负相关。
4.关键类群的数量随着多样性的增加而减少，但其网络影响却在增加。
摘要
管理土壤微生物群落来提高作物产量是现代农业的一个主要挑战，接种细菌可以克服这种挑战。在这项工作中为测试根际生态模式，在控制土壤条件下评估两种植物促生细菌。该模型指出，植物在贫瘠营养土壤中选择磷肥（P）增溶剂，在营养丰富的土壤中选择吲哚类化合物（ICs）生产者。用伯克霍尔德菌（Burkholderia）和肠杆菌（Enterobacteria）菌株在粘质土和沙质土壤中单接种或共接种水稻植株。采用绝迹稀释法指示每种土壤类型的多样性梯度。除了根际和内生细菌群落对磷的增溶作用和ICs的产生外，还评价了接种剂的存活率、定殖率以及对植物生物量的影响。伯克霍尔德菌株PGP效率在沙土中最高，其对P的溶解能力最高，而肠杆菌的PGP效率在粘质土壤中最高，后者具有最高的细菌ICs产生潜力。这些行为发生在模型假设的范围内，可用于PGPB测试和生物透视。我们强调肠杆菌菌株对多样性水平的强烈依赖性是影响PGP效率的最关键因素，可能如网络分析所示与低多样性中关键类群的影响增加有关。
背景与目的
1.接种有益菌对农业生产十分重要，但因为环境、菌株互作、菌株与植物互作导致PGPB效率降低。
2.在营养富集（肠杆菌属作为PGPB）与营养贫瘠（伯克霍尔德菌可作为PGPB）条件下菌株有不同的性状。
3. 我们检验（1）是否在肥沃土壤中生长的细菌比贫瘠土壤中的细菌能产生更多的吲哚类化合物（IC），而生长在贫瘠土壤中的细菌比在肥沃土壤中生长的细菌更能溶解磷。（2） 在肥沃的土壤中，是否内生细菌比根际细菌产生更多的ICs，反之亦然。（3）在肥沃的土壤中，是否溶P在根际比在内生中更频繁。相比之下，在贫瘠的土壤中较为相似。（4）作为维持模型的最关键点，我们还测试了是否随着细菌产生ICs的增加，细菌对P的增溶作用降低，反之亦然。（5）我们研究了伯克霍尔德菌是否构成了在贫瘠土壤中发挥其PGP效应最好的根际细菌，而肠杆菌是一种在肥沃土壤中表现出PGP效应的内生菌。（6）我们测试了较低的土壤多样性是否导致植物生物量降低，菌株存活率更高，菌株定殖率更高。
实验设计
1.菌株来源
伯克霍尔德菌（Burkholderia）和肠杆菌（Enterobacteria）是从水稻作物分离出来的，具有很好的PGPB性能。
2.建立微宇宙
采集两种土壤沙土（贫瘠）与粘土（富营养）灭菌，置于罐子中，然后，立即用10^-1、10^-3和10^-6的连续稀释液接种自然土壤中先前提取的微生物群落，以创建微生态多样性梯度（图1）
图1：实验设计方案。收集了被划分为“贫瘠”和“富饶”的自然土壤（a），将300 g消毒过的土壤放入0.3升的罐子中（b），未灭菌的部分用于连续稀释（c），连续稀释液立即作为接种物用于灭菌土壤，产生多样性梯度（d），经过三个月的微观成熟期（e），在盆（f）中加入预发芽的水稻种子和接种剂。接种后30天，收集所有植株（g）。P=贫瘠土壤，R=肥沃土壤。C=未接种对照品，B=伯克霍尔德菌株45，E=肠杆菌68株。M=混合菌共接种，上标“1，3，6”=10^-1，10^-3，10^-6稀释。像pb3这样的缩写是指在10^-3微缩稀释下接种了伯克霍尔德vietnamiens45菌株的贫瘠土壤。
3.植物指标
水稻种植后生长以茎长15dpi、地上部和根长30dpi和地上部干重30dpi测定植物生物量。
4.微观取样和CFU测定
在第1天、第5天、第15天和第30天采集Bulk soil。30天采集根际土与根内。并进行CFU计数。
5. 溶磷和吲哚类化合物的测定
以磷酸三钙（TCP）为基础的指示剂介质用于磷酸盐溶解试验，使用Salkowski试剂的吲哚类化合物（ICs）基于PC的检测方法。
6.群落与数据分析
16s rRNA基因测序生成OUT，网络分析基于MENAP。
主要结果
1.种植前微生物群落分析
微生物群落的组成根据贫瘠和肥沃土壤的多样性梯度而变化。在肥沃土壤中，chao-1多样性指数在各梯度水平上都有所降低，但在贫瘠土壤中，在10-3和10-6稀释度下相似。
图2：MENA 10^-1，10^-3，10^-6微区种植前微生物群落组成的共发生网络分析。每个网络节点（单个圆圈）代表一个OTU；节点的圆圈代表模块（包含四个以上的成员）。网络边缘表示为连接节点的直线，表示显著的共发生，红色表示正共生，蓝色表示负共生。Connectors（节点Pi>0.62）直接位于模块外部，而模块hub（Zi>2.5）位于模块中心。10-6微宇宙的模块1中的Connectors otu208（Pi>0.62和zi>2.5）朝向网络中心放置。节点大小表示每个分集级别上的读取频率，并且OTU标签被缩放到节点的中间中心度。所有三种多样性水平中出现的节点，如果其程度随着多样性的降低而增加，则以绿色显示；如果随着多样性降低，其程度降低，则显示为红色；如果节点的度数随着多样性的降低而波动，则显示为黄色。所有其他节点都是灰色的。被标识为梯形的节点被塑造成带有黑色边框的正方形，节点的边缘比其他节点之间的边缘更厚。
图3：跨多样性梯度的网络度量。深灰色条（顶部）表示网络指标，随着多样性的降低而增加。浅灰色条（中间）表示网络指标，随着多样性的降低而减少。灰色条（底部）表示在多样性梯度上波动的网络指标。粗体文本表示节点和边数相同的随机网络的显著差异。
随着多样性的减少，关键分类群的数量减少，但是它们对网络结构的影响（“关键性”）随着多样性的减少而增加。随着多样性的降低，节点数、连接数、模块化程度、平均路径距离和最大betweeness也有所减少。另一方面，power-law fit, average degree, maximal degree, average clustering coefficient与centralization of betweeness增加了。（具体网络的指标可见网络分析之基本概念和名词解释）
2.植物生长
图4：根据微宇宙多样性梯度（10-1，10-3，10-6），不同接种处理的贫瘠土壤中植物生物量（平均±2标准误）。（a） 接种后30天的茎长（b），接种后30天的根长（c）接种后30天的茎干重，（d）接种后15天的茎长。Control=未接种对照组，Burk=接种伯克霍尔德，Entero=接种肠杆菌Mix=混合接种。
植物在肥沃土壤中比在贫瘠土壤中发育得好得多，正如所预期的那样，但是多样性水平对细菌接种效率的影响在两种土壤中有很大差异。
图5：在肥沃土壤中，根据微宇宙多样性梯度（10-1、10-3和10-6），不同接种处理和植物生物量（平均±2标准误）。（a） 接种后30天的茎长（b），接种后30天的根长（c）接种后30天的茎干重，（d）接种后15天的茎长。
在肥沃土壤中（图5），茎长30dpi（F=6.432；p<0.001），根长30dpi（F=7.110；p<0.001），地上部干重30dpi（F=13.586；p<0.001），地上部长15dpi（F=7.736；p<0.001），表明接种效果依赖于多样性水平（所有交互作用p<0.001）。
3. 接种存活和定殖
图S4：根据微宇宙多样性梯度（10-1、10-3和10-6）和土壤类型（贫瘠和肥沃），接种剂存活率，如初始接种量为7.5±0.6 logCFU/ g下降到4 logCFU/ g所需的天数（平均±2SE）。误差线上方不同的字母显示了统计显著性的差异。（a） 伯克霍尔德菌株存活；（B）肠杆菌。红色=肠杆菌（Ent）接种；蓝色=伯克霍尔德菌（Burk）接种；绿色=混合菌株联合接种。
所有盆栽均收获了约9.5 log CFU作为液体接种剂（每克盆栽土壤总共7.3 log CFU），接种后24小时，我们从盆栽表面检测到新鲜Buik soil中接种剂的平均值±标准差为7.5±0.6 log CFU /g。
4. 增溶磷酸盐与IC生产能力
图6：不同微宇宙多样性水平、土壤类型、根系生境和接种处理的单LB菌落解磷热图。每个细胞顶部的数字表示菌落总数，底部表示校正后的残差值；它们可以解释为无效假设的标准偏差，即光晕发生与实验处理之间没有关联。（P-）=溶磷指示剂培养基中无晕轮，（P+）=在增磷指示剂培养基中有光环，Endo=内生菌落，Rizo=根际菌落，Burk=伯克霍尔德菌株接种，Control=未接种，Entero=肠杆菌接种， Mix=混合菌共接种。在这个条件下，光细胞=比预期少的菌落；暗细胞=在这些条件下比预期更多的菌落；灰色细胞=观察值和预期值之间没有显著差异（小于| 1.96 |校正后的残差）。
可培养菌群的磷酸三钙增溶活性（图6）随多样性水平的降低而增加（χ2=28.33；p<0.001）。在贫瘠土壤中的溶磷发生率高于肥沃土壤（χ2 =33.77；p<0.001），根际菌落也高于内生菌落（χ2=164.99；p<0.001）。接种处理也影响磷的增溶作用（χ2=9.34；P=0.025），接种肠杆菌株可减少增磷的发生。
图7：在King-B培养基上连续稀释土壤和根系样品的吲哚类化合物产量（平均±2倍标准误）。吲哚类化合物的产生培养物通过OD600nm进行标准化，以说明不同的接种细胞浓度。（a） 多样性效应梯度；（b）土壤类型效应；（c）根系生境效应；（d）接种处理效果。
单因素方差分析（图7）表明，随着微宇宙多样性的降低，ICs的产量减少（F=61.55；p<0.01），肥沃土壤的ICs产量高于贫瘠土壤（F=18.04；p<0.01）。内生群落的ICs产量也高于根际群落（F=21.33；p<0.01），但接种处理对ICs产量无影响（F=1.28；p=0.24）。
图8：微宇宙可培养细菌溶磷与ICs产生的相关性。P增溶数据基于图S8的校正残差；ICs生产数据与图S9相同；每个点代表来自同一植物盆栽的数据按土壤类型着色。阴影区域表示密度曲线。
5. CatPCA与特征基因分析
图9：贫瘠（a）和肥沃（b）土壤中所有变量的CatPCA。每一行代表一个变量，该变量从图的中心开始增加，较长的线说明了更多的差异。字母代表从每一个处理的三倍的质心。Axis显示每个维度解释的数据集的方差有多大。绿线=测量的植物性状（接种后30天的茎长，接种30天后的根长，接种后30天的芽干重，接种后15天的茎长），蓝线=伯克霍尔德菌（Burkholderia）定殖和存活，红线=肠杆菌定植和存活，紫色线=P增溶，橙色线=ICs生产，黑线=微宇宙稀释，黑色字母=对照（C），蓝色字母=伯克霍尔德菌（B），红色字母=肠杆菌株（E），绿色字母=混合（M）菌株联合接种。
肥沃土壤和贫瘠土壤的CatPCA分别解释了个测量植物性状（茎长30 dpi，根长30 dpi，茎干重30 dpi，茎长15 dpi），接种存活率、接种定殖率（Bulk、根际和内源）、ICs产量（来自根际和内生）和磷的增溶作用（来自根际和内生）多变量方差的63.64%和63.47%（图9）。在土壤肥沃的土壤中，这两个菌株的内生定殖量与所测植株性状呈正相关，而在贫瘠土壤中与实测植株性状呈负相关。同时，在贫瘠土壤中，这两个菌株根际和Bulk土壤定殖量与测定的植物性状呈正相关，而在肥沃土壤中与实测植株性状呈负相关。有趣的是，不管土壤类型如何，肠杆菌株的存活率与所测的植物性状呈负相关。然而，在贫瘠土壤中与测定的植株性状呈显著正相关，而在肥沃土壤中则与测定的植物性状呈负相关，表明其存活可能与PGP效率有关，但其效应取决于土壤类型。在两种土壤中，两种根系生境的ICs产量均与微生物稀释和根际菌落对磷的增溶作用呈负相关。在贫瘠土壤中，根长与ICs产量的关系比贫瘠的土壤更为密切，贫瘠土壤的地上部生物量与根际菌落对磷的增溶作用的相关性比肥沃土壤好。
图S10：网络指标与环境变量的相关性。特征基因分析显示模块和环境变量之间的相关性（R²和P值）。显著相关用粗体表示，绿色表示正相关，红色表示负989相关，黄色表示非显著相关。
总结
模型中的许多点都通过这项工作得到了证实。最重要的是，ics的产生和磷的溶解成反比关系，其次，在肥沃土壤中，肠杆菌比伯克霍尔德菌PGPB更好，而在贫瘠土壤中，伯克霍尔德菌比肠杆菌更好。我们认为该模型对指导PGPB测试和展望具有一定的参考价值。激发微生物群落是植物接种的关键因素，我们提供了一个明确的例子，相同菌株减少和提高植物生物量通过肠杆菌依赖于多样性的促进植物生长效果。
PGP活性的预测对农业生产是非常有用的，因此可以在适当的条件下使用合适的接种剂。通过剖析和测试植物-细菌-环境相互作用中的假设，了解这些条件并开发合适的微生物是可能的。
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