PNAS/被子植物根系微生物组的装配和生态功能

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题目：Assembly and ecological function of the root microbiome across angiosperm plant species

被子植物根系微生物组的装配和生态功能

期刊：PNAS

三年均IF：9.6

通讯作者：Connor R. Fitzpatrick

翻译：陈实  

意义

      生活在植物和动物体内的微生物群落有助于宿主的功能。宿主进化是如何形成相关的微生物群落，而这些微生物又是如何影响宿主的生态系统，这些相对来说还是未知的。在这里，我们证明了植物物种的进化发生影响根系微生物的多样性和组成。宿主植物根系微生物群落的高度相似性引起土壤负反馈从而降低植物性能。此外，干旱改变了根微生物群落的组成，其中特定细菌类群相对丰度的变化与植物对干旱的耐受性增强有关。我们的工作强调了与宿主相关的微生物群落在介导宿主与其生物和非生物环境之间相互作用的潜在作用。

摘要

       在植物和动物中，与宿主相关的微生物群落在宿主营养、发育和免疫中发挥着基本作用。形成宿主-微生物组相互作用的因素还不太为人所知，但对于理解这些共生生物的进化和生态却是必不可少的。植物的根与周围土壤组成了两个不同的微生物区室：根际(根周围的微生物)和根内(根内部的微生物)。根相关微生物是陆地植物进化的关键，是生态系统基本过程的基础。然而，植物的进化如何塑造根系微生物群落，以及这些微生物如何影响植物的生态系统，例如减轻生物和非生物胁迫的能力，在很大程度上仍是未知的。这里我们展示了30个被子植物物种之间的差异，这些差异影响了根系细菌的多样性和组成。宿主之间根系微生物群落的相似性会通过土壤反馈对植物性能产生负面影响，而根内和根际的特定微生物类群可能会影响植物物种间的竞争性相互作用。干旱也改变了根微生物群落的组成，最明显的是增加了放线菌的相对丰度。然而，这种干旱反应随宿主植物种类的不同而变化，并且宿主根内链霉菌相对丰度的特定变化与宿主的耐旱性有关。我们的结果强调了根微生物群变化的原因以及根微生物群对植物性能响应生物和非生物胁迫时的生态重要性。

实验设计

      种子及土壤来源：实验使用的19个植物科的30种植物种子是在过去15年从南安大略省单个开放授粉群体中的多株植物上收集的，所有的植物都共存于多伦多大学考夫勒科学保护区(KSR)，土壤也来自这里。

1、根部微生物比较研究

      我们将经消毒后的种子长成的子叶期的幼苗移植到1 L的花盆中，花盆中装满了从KSR收集的灭菌土壤（盆栽土和沙子的混合物=2:3）和活菌。我们将植物放置在生长箱中两周，温度设置为25℃，55%的湿度，16小时的光周期。发芽后，我们把这些植物搬到温室里。16周后收获根际和根内部分样本，每个标准的根样本包括三生根、根毛和根尖分生组织。提取总DNA，并利用Illumina MiSeq对16S rRNA基因的V4区进行测序，对细菌群落进行鉴定。我们使用DADA2 v1.4.0软件将质量过滤后的读本组装成错误修正后的扩增子变异序列(ASVs)，用于比较细菌类群的群落组成和差异丰度。

2、植物-土壤反馈（PSF）研究

      我们按照与上述温室实验相同的操作规程，在水源充足的条件下，对30种宿主植物均设置5个重复进行1代培养。在第1代结束时（12周），收集30个物种5个重复中的根外土和根际土壤，将土壤保存在-20°C直到第二代。在第二代中，我们选择了5个关键物种，它们代表了第一代30个物种的进化和表型宽度。用同样的方法使关键物种发芽，并将幼苗移植入500毫升的花盆中。将第一代收集的30种植物中的5个（包括关键植物本身的调节土壤）调节土壤，加上5个无菌盆栽处理，总共种植了155个关键植物x土壤处理的组合，每个组合设置4个重复。8周后，我们从每个花盆中收获所有地上和地下组织，并在60°C下烘干72分钟后称重，使用这些生物量测量值来计算我们的植物-土壤反馈度量。我们用不同的根微生物组组成和不同的细菌类群丰度来预测相互作用的植物物种对植物-土壤反馈（PSF）强度和方向的变化。

3、根部微生物组成与植物耐旱性研究

      在完全随机的区组设计中，每个宿主物种在充足水分和干旱条件下分别设置了5个重复，我们使用滴灌系统来精确地控制每个花盆的水量。实验过程中，每两周一次随机测量40个花盆的含水量体积百分比。同时，使用线性混合模型检验各处理是否显著改变了土壤水分。除了植物，在根微生物组特性研究中，还设置了与植物根系类似的经过相同处理的非活体结构（竹牙签）处理，根类似物在收集、DNA提取和根际/根内划分与植物根系处理相同。用于比较活根与和非活根类似物中的细菌群落以揭示干旱的间接宿主介导效应。

主要结果

1.根内和根际微生物群落在多样性和组成上因宿主植物种类而异

图1 ：在植物物种根内和根际部位的多样性和组成。（A）根内显示的多样性不到根际的四分之一；（B）区室（黑星号）和宿主植物物种（绿星号，根内；黄星号，根际）显著影响细菌门的数量；（C）与根际多样性相比，不同宿主植物根内多样性的变化更大。根内多样性也与潜在的植物系统发育相关，而根际多样性却不相关；（D）植物种类在其根内和根际的组成上差异更大。Mantel检验显示，根内(而非根际)的组成相似性和系统发育相关性之间存在显著相关性。

      在植物物种中，根际比根内具有更高的多样性和均匀性（图1A和附录 图S2和表S3）。加权UniFrac和主坐标分析发现根内和根际的微生物组群落组成存在明显差异（SI附录，图S3和表S4）。接近90％的细菌门和55％的细菌扩增子序列变体（ASV）在根内和根际区隔之间表现出明显的差异[一般线性模型（GLM）：校正错误发现率（FDR）后PFDR<0.05]（SI附录，图S4A）。在根内中，放线菌和拟杆菌门细菌表现出较高的相对丰度，而酸杆菌则显著减少（图1B）。宿主物种在其根内多样性上的变化（Simpsons’D−1 range：6–87；SE：8.2）比根际多样性大得多（range：111–315；SE：1.8；Levene’s test：F(1，58)=18.55，P<0.001）（图1C和SI附录，表S3）。同样，宿主植物物种解释了根内组成总变化的40％而根际组成只有17%。因此，在寄主植物物种之间，根内各分类学等级上的大量细菌类群的丰度差异显著（细菌类群：65％；ASV：12％），而根际受到影响的类群却少得多（细菌门：19%；ASV：1%；GLM：PFDR<0.05）（SI附录，图S4D）。此外，只有一小部分根内响应性细菌类群也受到根际寄主植物种类的影响（细菌门：36%；ASV：17%）。其中，变形菌门、放线菌门和拟杆菌门等几个门受到宿主植物种类变异的强烈影响（GLM：PFDR<0.05）（图1D）。在宿主植物物种中，我们发现根内和根际多样性之间相关性很小（Simpson’s D−1：r=0.06，P=0.09），尽管根内和根际群落组成之间存在显著相关性（加权Unifrac距离：r Mantel=0.26，P=0.04）。最后，我们在所有寄主植物物种中发现了133个根内和334个根际ASV(数据集S1)，表明尽管寄主植物物种之间存在巨大的变异，但核心微生物组合仍然普遍存在。

2.宿主植物物种之间的进化差异影响根内和根际微生物组的组装。

      为了了解植物的进化是如何形成根系微生物群落的，我们测试了近亲是否拥有相似的根内和根际微生物群落。根内微生物多样性（Blomberg’s K=1.08，P=0.001），而不是根际微生物（Blomberg’s K=0.67，P=0.94），表现出显著的系统发育信号（图1C和SI附录，表S6）。我们使用植物种类之间的系统发育相关性与根微生物群落相似性进行Mantel检验，以了解植物进化是否影响根微生物组的群落组成。同样，根内相似度（r Mantel=0.15，P=0.004），而不是根际（r Mantel=0.05，P=0.15）与植物物种之间的系统发育相关性正相关（图1D和SI附录，表S7）。根系微生物多样性与许多宿主植物性状有关，然而，个体性状的重要性在根内和根际之间是不同的（SI附录，表S8）。根内多样性与根毛密度的增加呈正相关，而根际多样性与宿主植物的生产力呈正相关，与根长负相关（PGLS：PFDR<0.05）。根内和根际组成也与其他许多植物性状有关，包括宿主植物的生产力、生理和根系结构特征（SI附录，表S8）（PGLS：PFDR<0.05）。

3. 宿主植物物种之间根系微生物组的变化通过PSF的间接竞争相互 作用影响。

图2 ：根微生物组成与PSF有关。（A）当一种植物招募的土壤微生物影响其他植物的生长时，就会发生PSF。正值表示相对于同种植物土壤，关键物种在异种植物调节的土壤中表现更好，而负值则相反。当把植物种在根内[以加权UniFrac距离衡量（B）]和根际[以未加权UniFrac距离衡量（C）]微生物组成不同的异种物种调节土壤时，植物表现生长增强。

      利用多代PSF（Plant-soil feedbacks）实验，我们研究了宿主植物物种中根部微生物募集的模式如何反馈以影响竞争性相互作用（SI附录，图S1）。在第一代中，我们将30种植物分别种植在同一场地采集的均匀土壤混合物中（盆栽土和沙子的混合物=2：3），作为比较微生物组的研究。在第二代中，我们在收集和保存了前代的30种植物的大块和根际土壤中，培养了5个关键物种，代表了我们的宿主植物系统发育多样性。第一代调节土壤对第二代植株性能的净效应是PSF。PSF可由生物和非生物土壤特性的改变引起，包括土壤细菌群落的改变以及土壤养分的消耗。我们计算出的PSF为：loge[（异种土壤中的关键物种生物量）/（同种土壤中的关键物种生物量）]；正值表明在异种植物的调节土壤中，一个关键物种比同种植物表现得更好，而负值则表明相反。

      我们试图通过不同植物物种贡献它们实验测得的PSF去了解根微生物群如何组装（图2A）。在我们的多代实验中，我们将宿主植物物种之间的根微生物组相似性（加权和非加权UniFrac距离）与它们的PSF相关联。值得注意的是，接种异种化植株调节土壤的效果取决于由关键植物和土壤调节植物物种组成的根微生物群落组装的相似性程度。平均而言，高度不同的微生物群落比高度相似的微生物群落更能促进关键植物的生长（图2B和C和SI附录，图S8）。

图3：根细菌分类群和PSF的丰度差异。宿主植物物种根内或根际中的大量根细菌分类群表现出不同的丰度，包括：（A）根内链霉菌ASV和（B）根际假黄色单胞菌属。我们估计了所有独立成对的关键植物(宿主植物系统发育的星状分类群)和土壤调节宿主植物物种中差异丰富的根细菌类群的log2倍数变化，并将其与测量到的PSF进行了关联。负的log2折射率变化表明土壤调节下宿主植物具有较高的分类单元丰度，而正值表明关键宿主植物具有较高的分类单元丰度。（C）关键与土壤调节宿主植物根内链霉菌的丰度差异与他们的PSF呈正相关；（D）而关键与土壤调节宿主植物的根际假黄单胞菌的丰度差异与他们的PSF呈负相关。（E和F）宿主植物间的PSF与66个根内分类群和33个根际分类群的差异丰度显著相关；（E）在根内，我们观察到大部分（35%）与PSF相关的分类群表现出C所描述的相关性（绿线显示了在PFDR<0.05时，根内分类群和PSF丰度差异的显著趋势线）。（F）而在根际中，高比例（88%）的分类群表现出D中所描述的关联（黄线显示了在PFDR<0.05时根际分类群和PSF之间的显著趋势线）。

      接下来，我们研究了特定的细菌类群如何促进根微生物组对PSF的作用。首先，我们使用GLM来计算所有成对的关键和土壤调节宿主植物物种之间每个分类单元丰度的log2倍数变化（即加倍）。我们在所有分类学等级中鉴定了细菌分类群，这些分类群在不同宿主植物物种根内或根际中都表现出明显的差异（图3A和图3B）。我们将宿主植物物种每种细菌类群的丰度差异与实验测量的宿主植物对的PSF进行关联。

      许多细菌类群与植物物种之间发生的正、负PSF强相关（PSF相关分类群），包括在所有宿主物种中发现的许多根内和根际ASV（代表性类群如图3C和D所示；完整列表，请参阅数据集S2）。特定ASV的差异丰度解释了宿主植物物种之间高达15％的PSF总变化（例如，图3C和数据集S2））。通常，当关键植物中细菌分类单元的丰度低于土壤调节宿主物种时，我们观察到关键植物的生长增强。相反，当关键植物中细菌分类单元的丰度大于土壤调节植物物种时，我们观察到关键植物的生长减少（例如，图3D和数据集S2，r值<0，无阴影行）。但是，我们注意到，对于某些微生物类群，关联被颠倒了（例如，图3C和数据集S2，r>0，蓝色阴影行）。此外，在与PSF显著相关的微生物分类群中，与根际（12％的分类群）相比，根内（分类单元的35％）中比例更大（图3E和F）（Fisher对比例差异：P=0.01）（数据集S2，r>0，蓝色阴影行）。

4. 根微生物组与宿主植物的耐旱性有关。

图4：干旱对根微生物群落的影响。（A）干旱处理（T表示）对根内和根际的多样性降低幅度较小（C表示），（B）对主要菌门的相对丰度影响较大；干旱对标星号的菌门相对丰度有显著影响(绿色，根内；橙色，根际)。（C）干旱对根内和根际微生物群的总体组成也有强烈影响，但在根内表现出更大的响应。（插图）干旱环境下的植物土壤湿度比充分浇水的植物土壤湿度低四倍。

       在比较根系微生物组的研究中，我们对每一种宿主植物的重复个体进行了长期干旱处理，结果发现，与充分浇水的对照植物相比，土壤水分的差异高达四倍。我们研究了这种非生物胁迫源如何影响30种宿主植物物种根部微生物组的多样性和组成。我们还在每个浇水处理中加入了10个未种植植物的花盆，其中装满了相同的土壤混合物。除了植物，在我们的根微生物组特性研究中，我们还设置了与植物根系类似的经过相同处理的非活体结构（竹牙签）。通过比较活根和非活根类似物的细菌群落，我们可以了解干旱对根系微生物群落的宿主介导效应。

      干旱使根内和根际的微生物多样性分别减少了15%和27%干[F（1，53）=5.56，PFDR=0.06（图4A）]。干旱还引起细菌群落组成的巨大变化（图4B和C和SI附录，表S3）。令人惊讶的是，干旱对根内的影响比对根际微生物的影响更大，这表明干旱通过改变寄主植物的生理或免疫状态而产生巨大的间接影响。与此结果一致的是，干旱导致了根内65%的菌门相对丰度的变化，而根际只有43%（GLM：PFDR<0.05）（SI附录，图S4C）。特别是，干旱区域内放线菌的丰度增加了两倍以上，而变形菌的丰度减少了近2.5倍（GLM：PFDR<0.05）（图4B，SI附录，图S9和数据集S3）。然而，在干旱期间，宿主植物的根内微生物群落变化的幅度不同，其中包括在水分充足的植物中发现的细菌的富集/消耗和在其根中招募新的类群（SI附录，图S5和S7）。干旱引起的活植物根系微生物群的变化不同于根系类似物根系土壤微生物群的变化。

图5 ：耐旱性与链霉菌科的关系。（A）平均而言，干旱处理（用T表示）导致生物量比充分水分条件减少35%[F(1,44)=17.37，P<0.001]，植物物种（用S表示）对干旱的响应差异显著（用单线连接的点表示）。（B）干旱导致根内链霉菌科（放线菌）的平均相对丰度增加了六倍，但是这种影响在植物物种之间有所不同。（C）在干旱条件下根内链霉菌相对增加较多的植物具有更强的耐旱性。

      我们试图了解干旱引起的根系微生物群的变化是否与植物的耐旱能力有关并用干旱和充足水分条件下总生物量的比例差异来衡量耐旱性。平均而言，植物对干旱的反应使总生物量减少了35%；然而，在应对干旱时，物种在生物量减少80%到增加127%之间变化(图5A和SI附录 图S10)。在整个植物系统发育过程中，我们没有发现耐旱性的系统发育信号。干旱条件下根系整体微生物组组成和多样性的变化与耐旱性无关。

      为了进一步研究根系微生物群是否影响耐旱性，我们研究了不同植物种类的单个细菌分类群是如何与耐旱性相关的。首先，对于每种宿主植物，我们使用GLMs计算各干旱响应分类单元在水分处理之间的log2折射率变化。我们鉴定了根内和根际所有分类学级别的细菌类群，它们在充足的水分和干旱条件下差异很大。接下来，我们将每个细菌分类单元的差异丰度模式与宿主植物物种的耐旱性相关联。我们发现了两个惊人的结果：首先，在干旱条件下，链霉菌科（所有ASV组合在一起，在每种宿主植物物种的根内体内都发现了其中的三个）在根内的丰度增加了3倍，但根际没有（SI附录，图S11）。然而，链霉菌科的丰富程度在不同的植物种类之间变化为0到4倍（图5B和SI附录，图S13）。其次，实验中每个宿主植物的根内都有一个链霉菌ASV相对富集，这解释了近40%的宿主植物耐旱性变化（图5C和数据集S4）。许多其他根内类群显示与宿主抗旱性强相关（r>0.4），包括在宿主高发生率下的另一种链霉菌ASV（数据集S4）。但是，除了图5C中所示的链霉菌ASV以外，在多次测试校正后，这些相关性均不显著（数据集S4）。重要的是，在对非活根样品进行检测后发现，在干旱条件下，活根中与耐旱性相关的所有根内ASVs在这些根系类似物的根内中均未富集（数据集S3）。

总结

      宿主相关的微生物群对动植物宿主的营养、发育和免疫至关重要，然而，我们对它们更广泛的生态重要性的理解仍然有限。我们的研究证明了宿主植物物种的宿主微生物发生变化的原因，并为这种变化对生物和非生物胁迫的普遍生态重要性提供了证据。这项研究也可能为今后在不同农业系统中设计根系微生物组以提高植物在面对竞争和干旱胁迫时的性能提供参考。

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