两个不同单细胞亚群差异分析，合并一定要做火山图

不止一个人粉丝在交流群提问，他单细胞差异分析的结果，因为p值过于显著，无限接近于0，导致火山图展现非常诡异！

这个是单细胞自身特性导致，它两个分组的细胞数量太多，大概率会导致p值过于显著，无限接近于0。我们以 SeuratData包里面的  pbmc3k 数据集举例说明：

library(SeuratData) #加载seurat数据集  
getOption('timeout')
options(timeout=10000)
# InstallData("pbmc3k")  
data("pbmc3k")  
sce <- pbmc3k.final  
library(Seurat)
table(Idents(sce))
deg = FindMarkers(sce,ident.1 = 'NK',
            ident.2 = 'B')
head(deg[order(deg$p_val),])

可以看到，我们这里使用  NK细胞和B细胞的差异结果：

> head(deg[order(deg$p_val),])
            p_val avg_log2FC pct.1 pct.2    p_val_adj
GZMB 3.186146e-97   5.507567 0.961 0.017 4.369480e-93
NKG7 1.262672e-94   6.262287 1.000 0.087 1.731628e-90
PRF1 1.835435e-93   4.612813 0.948 0.029 2.517115e-89
GZMA 3.036581e-93   4.466820 0.929 0.015 4.164367e-89
CTSW 3.151498e-93   4.203776 0.987 0.070 4.321965e-89
CST7 9.767143e-92   4.380031 0.948 0.038 1.339466e-87
> table(Idents(sce))

 Naive CD4 T Memory CD4 T   CD14+ Mono            B        CD8 T 
         697          483          480          344          271 
FCGR3A+ Mono           NK           DC     Platelet 
         162          155           32           14 

这个时候的差异分析结果其实就是两个单细胞亚群各自的标记基因，上面显示的NK细胞亚群相对于B细胞来说， 统计学显著上调的基因就是 "GZMB" "NKG7" "PRF1" "GZMA" "CTSW" "CST7" 这些耳熟能详的NK细胞的特性标记基因啦。

一个简单的火山图，使用EnhancedVolcano包 ，代码如下所示：

library(EnhancedVolcano) 
EnhancedVolcano(res,
                lab = rownames(res),
                x = 'avg_log2FC',
                y = 'p_val_adj')

效果如下所示：

还是说不错的火山图

因为这个举例的火山图还算是可以，并没有出现致p值过于显著，无限接近于0的情况发生，因为细胞数量并不多，就155个NK细胞和344个B细胞的差异分析而已。但是如果是大家的真实单细胞数据集，现在细胞数量都很可观，很容易出现 p值过于显著，无限接近于0的情况发生。上面的火山图代码可能会出现很诡异的可视化效果。

恰好我最近看到了一个有意思的展现方式，就是忽略这个统计学指标p值，因为反正都是统计学显著的，大于0.01即可，p值再小也不是我们关心的重点。

发表在NATURE COMMUNICATIONS | (2021)  的 文章：《CD177 modulates the function and homeostasis of tumor-infiltrating regulatory T cells》，链接是：https://www.nature.com/articles/s41467-021-26091-4

如下所示：

火山图的另外一种方式

文章对这两个图的描述是：

• c Differential gene expression analysis using the log-fold change expression versus the difference in the percentage of cells expressing the gene comparing TI versus PB Treg cells (Δ Percentage Difference). Genes labeled have log-fold change > 1, Δ Percentage Difference > 20% and adjusted P-value from Wilcoxon rank sum test <0.05.
• d Top eight upregulated genes by log-fold change in TI Treg cells with adjusted P-value <0.05.

左边的图c就是一个普普通通的散点图，但是添加了一些基因：

plot(deg$avg_log2FC,(deg$pct.1 - deg$pct.2))

右边的d和e图，就更简单的，就是普普通通的条形图，比较耗费时间的应该是把p值写进去条形图里面，最好是ggplot相关语法会方便一点。

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