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Counts FPKM RPKM TPM CPM 的转化

生信技能树 生信技能树 2022-08-10


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一、什么是RPKM、 FPKM、TPM、CPM

RPKM, FPKM and TPM, clearly explained - StatQuest!!!
对基因counts进行校正定量一般有RPKM、FPKM 、TPM和CPM这几种方法,StatQuest网站中对RPKM, FPKM 和 TPM作了通俗简要的说明,现将其核心要点整理如下:

RPKM

RPKM (Reads Per Kilobase Million, or Reads Per Kilobase of transcript per Million reads mapped)
每千个碱基的转录每百万映射读取的reads

计算RPKM的方法:

  1. 计算样本中的总reads,并将该数字除以1,000,000——这是我们的“每百万”缩放因子 ( “per million” scaling factor ) 。

  2. 将reads数除以“每百万”缩放因子。消除测序深度影响,得到每百万reads(RPM, reads per million )

  3. 将RPM值除以基因长度(以千碱基为单位),消除基因长度影响,得到RPKM。

FPKM

FPKM (Fragments Per Kilobase Million, or Fragments Per Kilobase of transcript per Million reads mapped) 每千个碱基的转录每百万映射读取的fragments

FPKM与RPKM非常相似。RPKM是针对单端测序的RNA-seq而言的,其中每个reads对应于一个已测序的单个片段。FPKM用于双端测序的RNA-seq。使用双端测序RNA-seq,两个reads可以对应一个片段(Fragment)。RPKM和FPKM之间的唯一区别是FPKM考虑到两次reads可以映射到一个片段(因此它不会对该片段进行两次计数)。
单端测序:reads=fragments,双端测序:2 * reads≈fragments
而经过上游处理,双端测序两个reads可以对应一个片段的过程已经完成,最后得到的counts就已经相当于是片段fragments了,因此下游分析由counts计算RPKM、 FPKM这两者的公式完全一致。

TPM

TPM (Transcripts Per Million, or Transcripts Per kilobase of exon model per Million mapped reads)
每千个碱基的转录每百万映射读取的Transcripts

计算TPM的方法:

  1. 将读数计数除以每个基因的长度(以千碱基为单位),得到每千碱基reads(RPK, reads per kilobase)。

  2. 计算样本中所有RPK值,然后将其除以1,000,000,得到“每百万”缩放因子 ( “per million” scaling factor )。

  3. 将RPK值除以“每百万”缩放因子,得到TPM。

因此在计算TPM时,与RPKM、 FPKM相比,唯一的区别是TPM先对基因长度进行标准化,然后对测序深度进行标准化。但是,这种差异的影响非常深远。因为使用TPM时,每个样本中所有TPM的总和是相同的,这样可以更轻松地比较每个样本中映射到基因的读数的比例。相反,使用RPKM和FPKM,每个样本中的标准化读数之和可能会有所不同,这使得直接比较样本变得更加困难。

CPM

CPM(Counts Per Million, or Counts of exon model Per Million mapped reads) 每百万映射读取的counts

除了RPKM、 FPKM、TPM这几种方法,CPM也是较为常见的一种基因定量方式。原始的表达量除以该样本表达量的总和,再乘以一百万,即可得到CPM值。CPM值只对测序深度进行了标准化,一般利用edgeR包的cpm()函数即可对基因counts进行简单校正 。
edgeR::cpm(counts)

二、由Counts计算FPKM/RPKM和TPM

有许多文章已经给出了这几种计数方式的计算和转化关系,如What the FPKM? A review of RNA-Seq expression units | The farrago (wordpress.com)

countToTpm <- function(counts, effLen) { rate <- log(counts) - log(effLen) denom <- log(sum(exp(rate))) exp(rate - denom + log(1e6)) } countToFpkm <- function(counts, effLen) { N <- sum(counts) exp( log(counts) + log(1e9) - log(effLen) - log(N) ) } fpkmToTpm <- function(fpkm) { exp(log(fpkm) - log(sum(fpkm)) + log(1e6)) } countToEffCounts <- function(counts, len, effLen) { counts * (len / effLen) } ################################################################################ # An example ################################################################################ cnts <- c(4250, 3300, 200, 1750, 50, 0) lens <- c(900, 1020, 2000, 770, 3000, 1777) countDf <- data.frame(count = cnts, length = lens)# assume a mean(FLD) = 203.7 countDf$effLength <- countDf$length - 203.7 + 1 countDf$tpm <- with(countDf, countToTpm(count, effLength)) countDf$fpkm <- with(countDf, countToFpkm(count, effLength)) with(countDf, all.equal(tpm, fpkmToTpm(fpkm))) countDf$effCounts <- with(countDf, countToEffCounts(count, length, effLength))



为了更清楚直观地明白FPKM/RPKM和TPM的计算过程,根据StatQuest定义给出的计算方法,自己重新写了由counts转化为FPKM/RPKM和TPM的计算公式代码,经过验证其结果与上面公式所得结果一致,那今后就用自己写的这些代码吧,具体代码如下:

#TPM (Transcripts Per Kilobase Million) 每千个碱基的转录每百万映射读取的Transcripts counts2TPM <- function(count=count, efflength=efflen){ RPK <- count/(efflength/1000) #每千碱基reads (reads per kilobase) 长度标准化 PMSC_rpk <- sum(RPK)/1e6 #RPK的每百万缩放因子 (“per million” scaling factor ) 深度标准化 RPK/PMSC_rpk } #FPKM/RPKM (Fragments/Reads Per Kilobase Million ) 每千个碱基的转录每百万映射读取的Fragments/reads #RPKM与FPKM分别针对单端与双端测序而言,计算公式是一样的 counts2FPKM <- function(count=count, efflength=efflen){ PMSC_counts <- sum(count)/1e6 #counts的每百万缩放因子 (“per million” scaling factor) 深度标准化 FPM <- count/PMSC_counts #每百万reads/Fragments (Reads/Fragments Per Million) 长度标准化 FPM/(efflength/1000) } #FPKM与TPM的转化 FPKM2TPM <- function(fpkm){ fpkm/sum(fpkm)*1e6 } tpm <- as.data.frame(apply(counts,2,counts2TPM)) colSums(tpm)
fpkm <- as.data.frame(apply(counts,2,counts2FPKM)) colSums(fpkm)
tpm0 <- as.data.frame(apply(counts,2,FPKM2TPM)) colSums(tpm0)

要注意一点的是计算FPKM/RPKM和TPM时,基因长度一般指的都是基因的有效长度effective length,即该基因的外显子总长度或转录本总长度,以此为标准来消除测序造成的基因长度影响才更为准确。


可参见生信技能树文章:基因长度之多少 | 生信菜鸟团 (bio-info-trainee.com)

关于如何得到基因有效长度,请参阅文章:获取基因有效长度的N种方法。

参考资料:RPKM, FPKM and TPM, clearly explained - StatQuest!!!What the FPKM? A review of RNA-Seq expression units | The farrago (wordpress.com)RPKM、FPKM、TPM详解RNA-seq的counts值,RPM, RPKM, FPKM, TPM 的异同 - 云+社区 - 腾讯云 (tencent.com)

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