《自然—生物技术》| 科学家实现迄今最高精度猕猴大脑三维高清成像
7月26日，中国科学院深圳理工大学（筹，简称中科院深理工）/中国科学院深圳先进技术研究院（简称“深圳先进院”）脑认知与脑疾病研究所毕国强教授、刘北明教授、徐放副研究员率领中科院深理工/深圳先进院、中国科学技术大学和合肥综合性国家科学中心人工智能研究院团队的最新研究成果发表于《自然—生物技术》。
研究团队历时五年，通过自主研发的高通量三维荧光成像VISoR技术和灵长类脑图谱绘制SMART流程，实现了猕猴大脑的微米级分辨率三维解析，这是目前世界上最高精度的灵长类动物的脑图谱。
大脑作为结构和功能最复杂的器官，是生命活动的司令部，识别大脑的三维结构，对脑科学研究有着重要作用。长久以来，为了能“看清”大脑的内部结构，了解其运转机制，科学家们都在尝试绘出一幅包含连接性,功能和微观结构的大脑高清“地图”并做出诸多努力，然而其技术难度极大。
大脑的所有意识、思维活动都通过神经纤维进行信号传输。神经纤维的直径是头发丝的1/100左右，而长度是直径的数十万倍。这是利用本项工作研发的SMART流程重建的猕猴脑中一根神经纤维的形状。
中科院深理工/深圳先进院副研究员徐放，中科大研究生、中科院深理工/深圳先进院脑所客座学生沈燕、丁露锋、杨朝宇是论文第一作者，脑所徐富强研究员、肖彦洋副研究员、技术员吴丰佚等是论文的共同作者。中科院昆明动物所胡新天研究员、麻省理工学院Robert Desimone教授、加州大学洛杉矶分校董红卫教授、南加州大学张砺教授等团队参与了此项工作。毕国强教授和刘北明教授是论文的通讯作者。
在猕猴层面实现大脑三维高清“地图”
大脑是一个三维立体结构，其内部的神经网络结构就像是地球表面错综复杂的道路与河流，绘制大脑图谱就是要把这些河流与道路测绘出来，精细分解和描绘大脑复杂的三维结构。
为了理解人类大脑，科学家需要将果蝇、小鼠等作为基准和模型，其中猕猴是研究最为深入的非人类灵长类动物，为理解人类大脑健康和疾病提供了最佳模型系统。由于技术限制，目前的脑图谱研究主要集中于小鼠层面，国际通用的成像技术对小鼠进行微米分辨率全脑成像通常需要数天的时间。猕猴脑体积为鼠脑的200倍以上，要在较短时间内完成猕猴全脑成像是一项极大的挑战。
此前，研究团队经过数年的攻关，研发了VISoR高速三维荧光成像技术，该项成果于2019年发表于《国家科学评论》。这一技术通过斜截面扫描照明与同步成像，实现了在样品连续运动时进行无模糊的图像采集，消除了传统大样品成像需要在不同的小视野切换、停顿所带来的时间损失，数据采集速度比当前通用于小鼠脑图谱绘制的几种三维光学成像技术提升了数十倍，使得猴脑图谱解析成为可能。
猕猴大脑的三维高分辨重建图（a）、截面图（b）、内部神经纤维展示（c），以及部分神经纤维的全脑示踪和可视化（d）
除了成像通量的挑战，对猕猴脑进行高分辨全脑成像还面临沟回结构复杂、组织透明度差等多方面的困难。在通过了严格审核的伦理规范下，科研人员对猕猴大脑展开研究，采取先对离体大脑进行包埋切片的方式，使得溶液渗透效率仅依赖于切片厚度，而不受其大小的影响，并且发展了高折射率的PuClear组织透明化方法，对脑片的灰质与白质不同部分、不同深度达到均匀透明。然后通过改进的VISoR2系统，最终对猕猴全脑样品在100小时内完成1×1×2.5微米三维分辨率的图像采集,项目中两只猕猴大脑图像原始数据量超过了1 PB，约相当于113块10T硬盘的数量存储大小。
VISoR2 工程简图
（左）猕猴丘脑神经元群体投射；
（右）猕猴丘脑神经元单轴突投射与追踪
“如此海量的数据蕴含着非常庞大的信息量，但也为数据分析带来极大的挑战。”徐放表示。面对庞大的数据体积，研究团队开发了自动的三维图像拼接技术，实现了猕猴大脑的三维图像重建。“目前这项工作只是一个非常初步的开始，未来我们还需要更多的数据科学家的合作参与，进行更深入的图像数据挖掘和分析，共同理解灵长类动物的大脑精细结构与智能的关系。”
实现神经元的长距离追踪，发现新路径
大脑有着上亿个神经元，其长长的神经元轴突就像是电线，延伸到大脑的各个区域，发挥着传输信号的功能。只有对全脑进行微米级分辨率的成像与重建，才能对单个神经元轴突形态进行完整描绘。
研究团队开发了渐进式的半自动追踪技术，实现了对神经元轴突的长距离追踪，并基于前期工作基础，发现了前所未知的猕猴轴突纤维投射特性及其在大脑皮质沟回处转折延伸的多种路径形态。
“VISoR技术作为当前世界最快的大尺度三维组织成像方法，可以对各种模型动物大脑进行高通量、高精度的定量解析，并可扩展至其它组织器官，在大规模药物筛选、快速病理诊断，以及更大型生物样品成像等领域都有广阔的应用前景。这项技术产生的超大规模数据与人工智能技术的结合，将有望帮助理解人类大脑和身体器官的精细结构及其在疾病中的变化规律，加速医疗诊断和药物研发，促进人类健康。”论文共同通讯作者毕国强表示。
据了解，研究团队将深入研究灵长类大脑结构的组成，以及其与大脑智能的关系和疾病中的变化，并与医院、人工智能相关公司开展合作，继续开发相关技术，用于动物及人类器官病理组织的高分辨全景三维成像。
专家点评
■ 点评1：
美国科学院院士、神经生物学与解剖学家、华盛顿大学David van Essen教授表示，研究团队克服了艰难的技术障碍，实现了完整的数据采集和分析流程，用于详细绘制和可视化单个猕猴神经元的长距离轴突轨迹和神经联接。该研究是一项技术杰作，标志着我们在猕猴整脑中准确有效地绘制长距离连接的能力取得了惊人的进步。他们的初步观察表明，大脑皮层下方白质中的许多轴突具有出乎意料的复杂轨迹，包括与皮层折叠相关联的急转弯。这一发现可能对理解大脑形态发生和“布线长度最小化”原则具有深远的意义。
■ 点评2：
中国科学院院士、浙江大学脑科学与脑医学学院院长段树民教授评论道，近些年来对小动物介观全脑图谱绘制技术取得了很大进展，但对灵长类等大动物全脑的介观成像，在很多技术层面（如成像速度，大范围高精度成像，大数据处理等）上仍然面临巨大挑战。毕国强团队研发的包括VISoR和SMART等集成技术为解决这一难题提供了可行的手段。
■点评3：
纽约大学神经科学全球教授（Global Professor of Neuroscience）, 斯沃茨理论神经科学中心联合主任汪小京教授表示，解析介观水平的大脑连接组很重要，但目前仅限于啮齿动物。这项工作展示了一种强大的方法，使研究人员能够在四天内以1微米的分辨率解析猴子的介观连接组。它代表了这个快速发展的领域的一项杰作。
■ 点评4：
美国艺术与科学院院士、加州大学圣地亚哥分校David Kleinfeld教授表示，毕教授和他的同事们建立了一个了不起的解剖学流程来标记和追踪猕猴大脑中单个神经元的输入和输出模式。单个脑细胞的几微米粗细的纤维网络在大脑内能够投射几十厘米的长度，他们的工作使得这些网络可以被并行地测绘出来。这项光学和系统工程方面令人印象深刻的成就，将推动自动组织学从小鼠大脑水平发展到200倍大的猴脑水平，它是对灵长类动物大脑接线图进行逆向工程的重要手段。
文字：刁雯蕙 徐放
图片：研究团队
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