青稞有约 | 贺永：从“生物墨水”到“生物混凝土”，3D生物原位打印有望成真

    混凝土是我们最为熟悉的建筑材料之一，石子通过被水泥浸润从而获得一定的强度。受此启发，浙江大学机械工程学院贺永教授团队（EFL团队），提出了全新的“生物混凝土”墨水思路：将预功能化的载细胞微球作为“石子”，高浓度GelMA水凝胶预聚液作为“水泥”，并开发了机器人原位生物3D打印系统，根据患者组织缺损处的形态，直接在缺损处沉积“生物混凝土”，实现组织再生及修复。相关论文近日发表于Nature Communications.

本期分享：浙江大学机械工程学院  贺永教授

本期推荐：中国工程院院士、浙大机械工程学院  杨华勇教授

你是怎样产生了“原位打印”的想法？

答： “原位打印”融合了生物3D打印及手术机器人，可实现在急性创伤处直接打印修复材料及细胞，实现高效精准的再生及修复。事实上，在五年前我就提出了Print@clinic的设想，希望能直接在手术台上进行打印修复，然而创伤处的环境复杂，原位打印及修复极具挑战。

为了实现这一目标，我们先从最简单的球及丝结构开始探究我称之为“迷你组织”的细胞微球、细胞微纤维的高效稳定制造。我当时的思路就是如能进一步的将“迷你组织”进一步三维组装，其组织再生及修复的效率要比常规的生物3D打印快的多，有希望满足原位打印快速修复的需求。

生物打印目前已经在现实生活中应用了吗？能否举一些案例？

答：狭义的生物打印是指基于3D打印手段，以细胞为单元在体外进行三维组装。而原位打印则是在生物打印基础上融合了手术机器人技术，实现实时根据病灶情况，打印墨水修复缺损组织缺损。目前生物打印有两大应用方向：其一是器官模型构建以更好的服务于药物评价，其二是组织的再生修复。目前打印的非活性（不载细胞）结构临床上有较多应用，典型的代表就是人工骨。载细胞打印目前在药物评价及筛选上已经有较多应用，打印的载软骨细胞的耳朵移植今年也已有临床报道。

你认为当前生物打印技术的发展面临的最大的局限是什么？

答：生物打印经过了近20年的高速发展，技术已日趋成熟。个人认为后续发展最大瓶颈有：

（1）原理层面，我们对组织及器官发育过程中的各个节点理解还不够深入，很容易打印出形似而神不似的结构；（2）技术层面，多细胞多材料的高效时空操控还不够成熟；（3）临床应用层面，由于载细胞结构移植到病人体内有较多的安全性考量，临床场景还需要进一步突破。

能否简单介绍一下“生物墨水”？它的材料性能是否是影响打印效果的最关键因素？

答：因为单纯的细胞无法直接组装，所以工程人员就通过细胞胶水（生物水凝胶）实现细胞在空间上的固定，而所谓的生物墨水其实就是细胞+“胶水”+生长因子等的组合。目前广泛应用的“胶水”材料包括胶原蛋白、明胶、多糖与脱细胞基质。“生物墨水”对打印的效果起着至关重要的作用。首先在成形方面，“生物墨水”需要具有可打印性，即合适的流变性能，保证打印工艺的顺利进行以及打印结构的最终成形；其次在生物相容性方面，“生物墨水”需要为负载的细胞提供合适的孔隙率、力学强度、相关位点，保证细胞的存活与分化；除此之外，“生物墨水”需要在植入体内后具有合适的降解速度、溶胀比例，并避免引起免疫反应。

 要实现“原位打印”，最大的挑战是否在于打印材料的研发？目前的生物墨水是否能满足原位打印的要求？

答：我们最近在《Nature Communications》上发表的文章中也有探讨，“原位打印”目前受限制的原因主要有两点：苛刻的生物墨水及打印过程要求。原位生物3D打印因为应用场景的变化，与常规生物3D打印相比增加了很多苛刻要求，目前应用的绝大部分生物墨水均无法胜任原位打印的工作，主要有以下几点原因：

（1）打印端环境多变：原位打印场景中，打印环境可能是战场、救灾等环境多变场合，要求墨水流变学性能稳定，当打印环境从低温到高温的大温度范围变化时不影响打印性能；

（2）修复处血水等影响：墨水要能在较高的体温及充满血水的浸润环境下保持结构不坍塌、打印的细胞能高效存活，并快速功能化以尽快起损伤修复作用；

（3）快速功能化：相比于常规生物3D打印中可以通过长时间灌流进行功能化相比，原位打印需要打印出的组织能快速发挥急救功能，如何让打印组织快速功能化是亟需解决的问题；

（4）优异的粘附性能：打印结构需与缺损组织间形成一定的结合力，防止其在体内修复中脱离缺损，造成二次损伤；

（5）急性救治便携性：墨水适合放入急救包中野外携带，用于军事、消防等高危领域的紧急救助。

在这篇文章中我们推出的“生物混凝土”墨水也正是基于这些挑战，逐一攻克了原位打印生物墨水方面的技术难点。

您所研发的“生物混凝土”，在生物相容性和力学性能等方面，实现了怎样的突破？

图：A组分微球在A-C墨水中的占比约为73.215%，可近似为晶体化学中的原子六方最密排布。

与常规生物墨水相比，“生物混凝土”墨水有如以下几方面的突破：

（1）墨水中的低强度细胞微球与高浓度水凝胶打印后在微观上类似一系列微球+弹簧，局部低模量，整体高模量，兼具细胞发育及打印结构形状维持能力；（2）墨水不是直接使用细胞做原材料，而是经过了培养并具有微组织功能的细胞球，打印后能更快地在受损位置发挥作用，加速组织修复；（3）墨水具有良好的温度稳定性，在4-37 ℃范围内均可原位打印；（4）由于墨水主体为稳定固化的水凝胶微球，其沉积于血水环境中也能维持3D形态；（5）得益于水凝胶预聚液对缺损组织表面的浸润及氢键作用，打印结构的粘附性好；（6）墨水可通过液氮冻存携带到野外，有望用于战场、救灾等恶劣环境下急性救治。

 这种“生物混凝土”的制备和“施工”过程是怎样的？

答：“生物混凝土”中的“石子”组分是由高压电场喷射工艺获得载细胞的水凝胶微球，并在后续培养过程中加入诱导培养基展开预功能化；而“水泥”组分则是直接配制的高浓度水凝胶预聚液，将二者按一定比例混合即获得了“生物混凝土”墨水。

在“施工”过程中，首先是获得患者器官缺损的三维模型并通过切片软件获得合适的手术机器人打印路径程序。在机械臂夹持端，将注射泵系统夹持于该机械臂上以实现墨水的恒流量供应。原位打印喷头选用锥形塑料喷头。根据患者不同的颅骨缺损3D结构进行原位打印。待打印结束后，利用405 nm蓝光手电筒对墨水进行光固化，最后将“患者”伤口缝合并对伤口消毒即可。

  “生物混凝土”可以用于哪些生物组织的损伤？

答：在这篇文章中我们是以骨组织为例，通过加入负载骨间充质干细胞（BMSCs）的“生物混凝土”墨水成功实现了动物颅骨缺损的修复，应该说绝大部分生物组织都有望利用“生物混凝土”墨水进行不同程度的修复。在后续对“生物混凝土”墨水的不断改良过程中，我们将对其他组织的损伤修复逐步探究。

在研究中，你们为一只小白鼠实现了在体打印颅骨。这类颅骨损伤，目前临床上的方法是什么？用生物混凝土进行原位打印，在哪些方面体现出优势？还有哪些不足？

答：目前临床上是通过PEEK材料根据颅骨缺损的三维结构构建假体，利用PEEK假体进行颅骨修补手术，并结合一定的药物治疗。利用“生物混凝土”墨水进行原位打印的优势体现在其100%的生物组分，可以在组织学层面促进颅骨缺损的自行修复，而非简单通过假体对颅骨进行修补。同时，在未来随着人工智能技术的发展，手术机器人可以在实时的视觉分析中自行获得缺损的三维结构并快速沉积生物墨水，大大缩短手术时间并降低病人的痛苦。目前“生物混凝土”墨水的不足主要在于其组分的进一步优化以及对于其他组织的治疗作用有待探究，同时由于该墨水体系需要通过光引发剂及光照进行交联，因此其在真正进入临床前，需要经过一系列评估和相关部门的审核，确定其临床安全性和适用症范围。

 能否谈谈，未来的临床治疗或急救场景有怎样的想象空间？

 图：3D生物原位打印便携包。墨水可以保存在保温杯内，非常便携。结合小型机器人打印系统或手动打印模式即可在野外快速进行原位修复手术 。

答：很多重要的发明都来自于看似不可能的想象，所以我们不妨大胆畅想以后的治疗场景。我记得我在电影《王牌特工》中看到过这样一幕：特工哈里的头部中枪倒地，后来被发现并带回了基地抢救，抢救方法是一项黑科技，救援人员先把哈里的头包起来，再注入抗震水凝胶并用纳米技术修复头上的伤口，最后他成功复活。虽然这个桥段观众们都吐槽有些无厘头，也与当前的医疗发展程度严重不符，但我想，未来的临床治疗和急救场景一定是和电影中的场景一样，是十分便携、快速、智能、高效的。我想到那时，在战场、火情、抗震救灾等场景中，会有大量的高智能机器人手提着装有优化N代的“生物混凝土”墨水的急救包，自主发掘伤员、分析伤员伤情及缺损结构，并利用“生物混凝土”墨水对缺损进行原位打印，使伤员不错过最佳的救助时机。

国际上还有同类技术或产品吗？

答：据我们前期的调研，目前尚未有“生物混凝土”这一思路的原位打印墨水体系。但关于水凝胶微球的“二次打印”是有一些报道的。“二次打印”概念是近些年来生物3D打印领域新兴的研究课题，其特指将已打印成形的3D结构单元聚集，形成新的生物墨水再次用于生物3D打印中。水凝胶微球作为一种体积小巧而具有特殊流变特性的结构单元在“二次打印”技术中具有重要的研究地位。Chen等人成功使用GelMA/壳聚糖复合微球作为生物墨水辅助组分进行多尺度支架的打印，实验结果表明该类基于微球的“二次打印”方案在周围神经组织再生领域将具有巨大的应用潜力。2018年，Highley等人同样开发了一种新的生物3D打印策略，其中生物墨水完全由通过微流控技术产生的微球组成。与Chen等人在上述工作中的低密度微球不同，该工作中用于挤出式3D打印的生物墨水完全由微球组成，生物墨水中的微球彼此紧密堆积并相互制约。这些研究也为我们“生物混凝土”墨水在可打印性方面的研究提供了十分重要的依据。

贺永教授团队（EFL团队）链接：

https://person.zju.edu.cn/heyongzju#0

论文链接：

https://doi.org/10.1038/s41467-022-30997-y

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