【Science】新知！匈牙利科学院揭示脑干无名核上行调控场景记忆的编码！

去年今日此门中，人面桃花相映红。

人面不知何处去，桃花依旧笑春风。

----崔护《题都城南庄》 

图片来源：百家号

望着清明时节落英缤纷的桃花，故地重游的崔护想起了去年今日桃花源中的姑娘。此情此景，令人感伤。这首闻名古今的唐诗所描述的内容，便是我们题目中所说的场景记忆。相似的时节，相似的场景，让崔护想起了心心念念的姑娘。

图片来源：堆糖

对于情景记忆的研究，科学工作者常以小鼠作为模式生物。不同于人类，小鼠在忆起相似场景时，既不会赋诗题词，也不会通过语言来表达。由此，工作者们引入场景恐惧范式：当小鼠进入一个新场景时，给予其足底电击等厌恶性刺激以令之恐惧。一段时间后小鼠再次进入此场景，回忆起之前的经历，恐惧之情油然而生，于是战战兢兢、如临深渊、如履薄冰。工作者便以战栗行为作为场景记忆的表征。 

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过去的研究表明，场景记忆主要由背侧海马锥体神经元所编码[1]，其中参与记忆形成的锥体神经元数量必须被严格控制[2]，因为如果相关信息激活过多锥体神经元，记忆痕迹将会缺乏特异性[3]。海马锥体神经元的活性受表达生长激素抑制素（Somatostatin，SOM）的抑制性中间神经元（SOM中间神经元）调控[3]。与之对应，倘若过多锥体神经元受到抑制，其编码的记忆痕迹将会受到破坏，不够完整[4]。

因此，为实现海马锥体神经元的活性平衡，SOM中间神经元的活性应受严格调控。然而，对于SOM中间神经元的抑制性输入环路机制，我们尚未可知。

大脑海马

图片来源：Science news for students

2019年5月24日，《Science》杂志在线刊登了匈牙利科学院Gabor Nyiri教授的最新重要工作[5]，他们发现脑干无名核（Nucleus incertus, NI）中GABA能神经元选择性抑制海马SOM中间神经元，从而实现海马锥体神经元的活性平衡，进而调控场景记忆的编码。该研究首次揭示海马SOM中间神经元抑制性输入的环路机制，极大提高了人们在学习记忆领域的认知。

Gabor Nyiri

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结果

1.NI GABA能神经元选择性抑制海马SOM中间神经元

过去研究表明，NI对隔核-海马系统产生抑制性上行投射，NI神经元活性与海马θ节律密切相关[6, 7]。为研究NI GABA能神经元的下游投射，作者在vGAT-Cre小鼠的NI中注射AAV-DIO-eYFP以顺行示踪NI GABA能神经元，发现海马stratum oriens亚区与齿状回门区中存在大量eYFP阳性神经纤维（图1A-C），海马SOM中间神经元只存在于此二亚区中[8]。接着，他们在SOM-Cre小鼠的海马中注射AAV-DIO-eYFP，发现多数NI轴突末梢靶向SOM中间神经元（图1D-E）。通过冷冻电镜方法，他们发现NI GABA能轴突末梢与SOM中间神经元之间形成对称性突触（图1F-I）。再然后，他们在vGAT-Cre小鼠的NI中注射AAV-DIO-ChR2，通过膜片钳电生理记录方法，发现光激活NI神经元轴突末梢引起海马SOM中间神经元产生抑制性突触后电流（图1J-N）。

综上，NI GABA能对海马SOM中间神经元产生抑制性直接投射。

图1 NI GABA能神经元选择性抑制海马SOM中间神经元

2.NI GABA能神经元抑制MS兴奋性投射神经元

另有研究指出，海马SOM中间神经元的主要兴奋性输入来源为内侧隔核（Medial septum, MS）中谷氨酸能与胆碱能神经元[9]。为研究NI是否可通过抑制MS相应神经元以间接抑制海马SOM中间神经元，作者再次在vGAT-Cre小鼠的NI中注射AAV-DIO-eYFP以顺行示踪NI GABA能神经元，发现MS中存在大量eYFP阳性纤维，且形成GABA能突触连接（图2A-D）。然后，为研究NI GABA能神经元下游细胞类型，作者在vGluT2-Cre或ChAT-Cre小鼠的MS中注射AAV-DIO-eYFP，发现MS谷氨酸能与胆碱能神经元表面存在NI GABA能神经元纤维末梢（图2E-H）。最后，作者将不同颜色逆行示踪染料注射与野生型小鼠的MS与海马中，发现NI中很多上游神经元染料共标（图2I-K）。

结合图1、图2两部分结果，我们得知，NI GABA能神经元既可通过GABA能投射直接抑制海马SOM中间神经元，也可通过抑制MS兴奋性投射神经元进而间接抑制海马SOM中间神经元。 

图2 NI GABA能神经元抑制MS兴奋性投射神经元

3.NI GABA能神经纤维被多种环境刺激快速激活

为研究NI GABA能神经输入是否参与多种感官刺激相关功能，作者在vGAT-Cre小鼠的NI注射AAV-DIO-GCaMP6f，在背侧海马植入成像窗以实现双光子钙成像（图3A-C），发现小鼠追求水滴时NI GABA能神经纤维被激活（图3D-H），与之前研究一致[7]。此外，海马中NI GABA能神经纤维末梢被多种刺激激活（图3I-J）。

图3 NI GABA能神经纤维被多种环境刺激快速激活

4.NI GABA能神经元接受处理多种环境刺激相关脑区的投射

为研究NI GABA能神经元接受哪些脑区投射，作者在vGAT-Cre小鼠的NI中注射辅助病毒与狂犬病毒（图4A-B），发现NI GABA能神经元的上游神经元位于前额叶皮层、外侧僵核、未定区、乳头状核与中缝核区域（图4C），均与环境刺激相关。接着，作者分别在vGluT2-Cre或CRH-Cre小鼠的外侧僵核、内侧中缝核或MS中注射顺行示踪病毒，证实外侧僵核、MS中谷氨酸能神经元、内侧中缝核中促肾上腺素皮质激素释放激素神经元均投射到NI（图4D-L）。 

图4 NI GABA能神经元接受处理多种环境刺激相关脑区的投射

5.NI GABA能神经元调控海马神经网络功能

过去研究表明，海马θ活性对场景记忆的编码至关重要[4]，于是作者探究NI GABA能神经元对海马θ活性的影响。他们在vGAT-Cre小鼠的NI中注射AAV-DIO-ChR2并植入光纤，在背侧海马植入多通道线性探针（图5A-D），发现光激活NI GABA能神经元后，小鼠海马θ活性显著降低，此种效应在高频θ范围中更为明显（图5E-G）。

图5 NI GABA能神经元调控海马神经网络功能

6.NI GABA能神经元双向调控场景记忆的形成

上文结果已知，NI GABA能神经元可整合多脑区信息，并直接或间接抑制海马SOM中间神经元。这些发现暗示NI GABA能神经元可能通过抑制海马SOM中间神经元从而平衡编码场景记忆的海马锥体神经元的数量。

为验证上述假设，首先作者在vGAT-Cre小鼠的NI中注射AAV-DIO-ChR2并植入光纤，将小鼠置于新环境（场景A）并给予足底电击，实验组小鼠给予蓝光刺激。24小时后，再次置入场景A时，对照组小鼠表现出战栗行为，实验组小鼠无战栗行为且焦虑水平更低（图6A），表明场景记忆的形成可被光激活NI GABA能神经元阻断。

其次，为证实NI-海马的环路功能，作者使用相同病毒注射方法，光纤植入位点改为双侧海马。相同的行为学范式中，他们发现实验组小鼠同样无战栗行为（图6B），表明场景记忆的形成可被光激活NI-海马环路阻断。

再次，为探究上述行为学实验中的时间精确性，作者再次使用相同病毒注射方式，在NI植入光纤，并将小鼠分为两组：第一组足底电击时提供蓝光刺激，第二组足底电击间隙提供蓝光刺激，发现第二组小鼠第二天在场景A中的战栗时间显著长于第一组小鼠的（图6C），表明光激活NI GABA能神经元阻断场景记忆需在提供足底电击时。

最后，作者探究抑制NI GABA能神经元是否产生相反效应。他们在vGAT-Cre小鼠的NI中注射AAV-DIO-ArchT并植入光纤，将小鼠置入场景A中，提供其三段声音，在声音结束时给予足底电击，实验组小鼠全程给予黄光刺激。24小时后，小鼠再次置于场景A中，实验组小鼠战栗行为显著多于对照组小鼠，而提供声音线索引起的战栗行为（此行为不依赖于海马[10]）无变化（图6D），表明抑制NI GABA能神经元后小鼠场景恐惧记忆加深，且NI GABA能神经元对场景恐惧编码的调控作用依赖于海马。 

图6 NI GABA能神经元双向调控场景记忆的形成

总结

学习和记忆是人与动物生存不可或缺的重要功能。学习是指人与动物获取关于外界信息和知识的过程，记忆则是将获得的信息编码、贮存和重提取的过程。场景记忆是记忆的一种，由背侧海马锥体神经元编码。其中锥体神经元活性受海马SOM中间神经元调控，此调控作用的平衡十分重要，过强过弱均会导致错误记忆的编码。然而，对于调控SOM中间神经元的脑区，我们知之甚少。本篇文章结合转基因小鼠、光遗传、电生理、双光子钙成像、行为学等多种方法，首次发现NI GABA能神经元可通过直接或间接环路抑制海马SOM中间神经元，从而调控场景记忆的精确编码（图7）。

图7 调控场景记忆编码过程的上行环路机制

临了，笔者在最后补充一下。这篇文章虽然发表于Science Article，也并非完美无瑕。他们力求证明NI GABA能神经元通过抑制海马SOM中间神经元调控锥体神经元的活性，因为锥体神经元活性才是编码场景记忆最重要的一环。而这篇文章并未探究激活或抑制NI GABA能神经元对海马锥体神经元活性的影响，文章中的光激活范式可能作用于背侧海马各类神经元从而影响场景记忆的编码，并非一定作用于SOM中间神经元-锥体神经元局部环路。当然，瑕不掩瑜，这项研究阐释了调控场景记忆编码过程的上行环路机制，为临床解决恐惧症等相关疾病提供有力帮助！

OBiO

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参考文献

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[2].Tanaka, K.Z., et al., The hippocampal engram maps experience but not place. Science, 2018. 361(6400): p. 392-397.

[3].Lovett-Barron, M., et al., Dendritic inhibition in the hippocampus supports fear learning. Science, 2014. 343(6173): p. 857-63.

[4].Misane, I., et al., GABA(A) receptor activation in the CA1 area of the dorsal hippocampus impairs consolidation of conditioned contextual fear in C57BL/6J mice. Vol. 238. 2012.

]5].Szonyi, A., et al., Brainstem nucleus incertus controls contextual memory formation. Science, 2019. 364(6442).

[6].Nunez, A., et al., Nucleus incertus contribution to hippocampal theta rhythm generation. Eur J Neurosci, 2006. 23(10): p. 2731-8.

[7].Ma, S., et al., Heterogeneous responses of nucleus incertus neurons to corticotrophin-releasing factor and coherent activity with hippocapal theta rhythm in the rat. J Physiol, 2013. 591(16): p. 3981-4001.

[8].Freund, T.F. and G. Buzsaki, Interneurons of the hippocampus. Hippocampus, 1996. 6(4): p. 347-470.

[9].Fuhrmann, F., et al., Locomotion, Theta Oscillations, and the Speed-Correlated Firing of Hippocampal Neurons Are Controlled by a Medial Septal Glutamatergic Circuit. Neuron, 2015. 86(5): p. 1253-64.

[10].Basu, J., et al., Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition. Science, 2016. 351(6269): p. aaa5694.