miRNA的RT-qPCR验证，小伙伴儿亲测，高效，便宜，不限物种（附各试剂货号）
做了miRNA-seq，找到差异表达miRNA后，要做验证，Taqman探针好贵，LNA也没便宜多少~
要做的miRNA不在列表里，还要定制，更贵，时间更长~
有什么高效且经济的方法吗？
小丫今天推荐带接头的引物+SybrGreen染料法：
一步完成加polyA尾巴和反转录；
用软件miRprimer设计基因特异的上下游引物，用SybrGreen做qPCR。
溶解曲线漂亮，Ct值20出头，跟miRNA-seq趋势一致；
小丫的小伙伴儿亲测，人、小鼠、果蝇，都有效。
原理一目了然：
第一步：设计基因特异引物：
小丫喜欢把该物种的所有miRNA都设计出来，需要做哪个基因，把相应的引物复制出来就好。
1. 到miRBase下载该物种的所有miRNA序列：
进入http://www.mirbase.org，点击Browse；
Expand all，点击你要的物种的拉丁名；
进入这个页面：
在最下方，选择Mature sequence，点击select all，点击Fetch Sequences，就获得了该物种的所有miRNA成熟体序列。
复制，粘贴到一个文本文件中，一定要扩展名是txt的那种最简单的文本文件，文件名一定要叫input_miRs.txt。
2. 进入https://sourceforge.net/projects/mirprimer，下载miRprimer，把这7个文件都下载到同一个文件夹，给文件夹取个名字叫miRprimer。
把第一步获得的input_miRs.txt文件也放入miRprimer文件夹中。它一次最多计算25个miRNA的引物，所以，如果你的miRNA列表超过25个，需要分多次放入imput_miRs.txt文件当中。
注：文件名只能是input_miRs.txt，否则这个软件不认识~~
在Windows系统下双击miRprimer2.exe，会有个黑色窗口闪过，然后生成5个文件。啥参数，啥输入文件名，统统不用设置。
其中最好的一对在result_best_primer_pairs.txt文件里：
亲测20个miRNA，最好的这一对引物就很好用，溶解曲线很干净，Ct值介于20-30之间，所以每个基因先合成一对引物就好。
如果第一对不够好，就查看result_all_primer_pairs.txt，合成第二对引物试试看。
第二步：合成通用的反转录引物和基因特异引物。
反转录引物序列：5’-CAGGTCCAGTTTT TTTTTTTTTTTVN, where V is A, C and G and N is A, C, G and T.
跟第一步获得的基因特异引物一起送公司合成，PAGE级别。
第三步：加polyA和反转录
反应体系如下：
1ul 10X polyA polymerase buffer（NEB, M0276S）
1ul 1mM ATP（20ul 10mM + 180ul H2O）
1ul 10uM RT-primer
1ul 1mM dNTP（NEB, N0447S, 20ul 10mM + 180ul H2O）
0.5ul 200U/ul SuperScript® III Reverse Transcriptase（Invitrogen, 18080093）
0.2ul 100U/200ul polyA polymerase （NEB, M0276S）
10pg to 100 ng RNA sample
complete with RNase-free water up to 10ul.
反应条件如下：
42C, 1h；95C, 5min
稀释：
4 ~ 8 X，分装，-20C冻存。
第四步，RT-qPCR
反应体系：
10ul SybrGreen Master Mix（Roche, 4913914001）
9ul primer（50ul 2uM Forward primer + 50ul 2uM Reverse primer + 900ul H2O）
1ul cDNA
反应条件：
95C, 5min;
95C, 15s; 60C, 30s; 40 cycles
95C, 15s;
60C, 30s;
4C, 1h
仪器：ABI StepOnePlus
注：原文使用的反转录酶是NEB的MuLV，亲测1/3的miRNA的Ct值超过了30，改用Invitrogen的SuperScript® III Reverse Transcriptase，所有miRNA的Ct值降至20出头。
所以推荐使用反转录效率高的SSIII，价格贵一半，效率高2的n次方。
参考文献：
方法：doi:10.1186/1471-2105-15-29
软件：doi:10.1186/1472-6750-11-70
protocol：10.1007/978-1-4939-1062-5_7
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