一篇运用ChIP-seq研究组蛋白修饰位点的文献

明天就要放假啦，激动之余，小编决定长假来临之前，分享一篇ChIP-seq文献，理理思路，帮助小伙伴尽快把实验开展起来呢 。

题目：小鼠胚胎干细胞中SETDB1独立调节H3K9三甲基化过程中发育相关基因PRC2活性   

杂志： Genome research, 2015，IF=11.3

首先看下这篇文章的整体概述，手残的小编特意画了个相互关系图。

SETDB1是一种促进H3K9 甲基化修饰的组蛋白甲基转移酶。作者首先用ChIP-seq对H3K9me3做了4个重复，结合前人的SETDB1ChIP-seq 实验数据进行比对，得到了两种SETDB1peaks位点：solo peaks和ensemble peaks。ensemble peaks位点附近有H3K9me3峰值，而solo peaks附近没有。对solo peaks位点靶基因进行GO分析，发现大部分基因富集在神经发育调节功能中，而这部分基因又与核心蛋白复合体（PRC2）相互关联。PRC2结合位点附近一般伴随着丰富的H3K27me3修饰，H3K27me3修饰会抑制SETDB1修饰H3K9me3。通过SETDB1敲除，发现H3K27me3减少，神经分化得到促进。

下面详细解说下这篇文献的研究思路：

1 通过ChIP-seq发现SETDB1的两种peaks位点 

作者对SETDB1运用ChIP-seq做了4个重复，把得到的数据和之前研究者做的SETDB1ChIP-seq数据放在一起比对，发现peaks有两种类型。一种是SETDB1peaks附近没有H3K9me3的峰值，作者把这种定义为solo peaks（图A）；另一种SETDB1peaks附近有H3K9me3的峰值，定义为ensemble peaks（图B）。

用这两个SETDB1peaks位点附近的基因采用ChIP-qPCR实验验证了下。

2 SETDB1 solo peaks 靶基因富集在发育调节通路

对 SETDB1 peaks富集的结构区域进行了注释，和GO分析，发现大部分SETDB1 solo peaks靶基因富集在神经系统发育功能通路中（图B）。随即用tamoxifen敲除掉小鼠胚胎细胞SETDB1 基因，发现缺失SETDB1蛋白后神经分化增加了（红色指示）（图C）。作者推测SETDB1可能参与调节神经发育相关的基因。

3 部分SETDB1 solo peaks位点与PRC结合位点重叠 

作者把前人发表的SETDB1 solo peaks位点附近的与神经发育相关的43个转录因子数据放在一起进行了结合强度比对，发现5个转录因子与这些位点结合强度较高（图A），而这5个因子都属于PRC复合体。PRC复合体介导H3K27me3修饰，随后对位点5kb范围内2689个SETDB1 solo peaks根据几个因子的结合强度进行聚类，果然发现H3K27me3大量聚集二H3K9me3很少，说明这些位点发生大量的H3K27me3修饰而不是H3K9me3修饰(图B)。图C为这种情况下的各个因子的ChIP-seq peaks示例。

4 H3K27甲基化抑制SETDB1介导的H3K9me3修饰

在体外以重组核小体为基质，运用不同甲基化结合抗体进行甲基化程度检测。发现上调EZH2（PRC复合体中的一种）的表达会导致H3K9me3降低。加入H3K27me3孵育，也会导致H3K9me3降低。说明H3K27甲基化抑制H3K27me3。另外，将shRNA导入细胞消除掉Ezh2后，ChIP-qPCR发现消除掉Ezh2后SETDB1 solo peaks位点的H3K9me3程度明显变高，可能在该位点H3K9me3和H3K27me3修饰存在竞争关系。

5 SETDB1与EZH2修饰H3K27甲基化间的相互作用

为了研究SETDB1修饰H3K27的机制，作者对SETDB1，EZH2和SUZ12（PRC2）进行了免疫共沉淀，发现三者是以共聚体的形式存在和发挥功能（图A）。用SET结构缺失的SETDB1再次进行免疫共沉淀，SETDB1还是能将EZH2和SUZ12拉下来，说明SETDB1中和PRC2结合的结构区域不是SET（图B）。

作者检测了EZH2结合位点SETDB1敲除前后的H3K27me3程度的变化，发现SETDB1敲除后，H3K27me3上升（图C）。EZH2和H3K27me3 ChIP-qPCR检测SETDB1敲除前后SETDB1 solo peaks与PRC2重叠位点的EZH2和H3K27me3的富集变化（图D-G），SETDB1敲除后EZH2与该位点结合程度降低，H3K27me3降低。说明在EZH2单独结合位点，SETDB1两个对H3K27me3修饰是相互拮抗的，而在ETDB1 solo peaks与PRC2重叠位点，SETDB1与EZH2修饰H3K27甲基化的相互作用的方式是协同的。

另外，RT-qPCR检测49个SETDB1 solo peaks和PRC2重叠位点的靶基因在SETDB1敲除后的变化程度（图H），说明上游SETDB1不与靶基因结合后，较大程度的影响了下游靶基因的表达量。

文献解析到此就结束了，最后，祝各位小伙伴国庆假期快乐！节后见。

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