前面三期铺垫了DNA测序的三种方法的优缺点、高性价比的设计实验、质量问题的原因，以及各种找变异位点的工具的优缺点，讲的都是经验和comment。如果想跟着案例一步一步模仿，请移步生信技能树。

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终于可以切入我最想解决的问题了：

“变异会影响基因转录调控吗？”

问题的提出

问题1：GWAS获得的很多变异位点位于non-coding区域，它跟表型的关系是怎样的？

或者，我想从转录调控机制入手，我关心的是SNP对基因转录调控的影响，该怎样分析呢？

问题2：GWAS发现的变异位点本身可能并不能导致疾病，它附近可能存在一个high linkage disequilibrium（LD）位点，那才是致病原因。

或者：我查的SNP没影响转录调控，这样就结束了吗？还可以继续努力，有可能它旁边的SNP才是Mr. Right，怎样找到这个Mr. Right呢？

本期回答问题1，下期回答问题2。

方  法

Stanford University的Synder Lab的Collin Melton在2016年ENCODE会议上介绍了这个问题的研究策略：用ENCODE数据给变异做注释。

Variant Annotation using ENCODE Data: An Introduction to RegulomeDB and HaploReg 

https://v.qq.com/txp/iframe/player.html?vid=o05053xp8w6&width=500&height=375&auto=0

回复regulomeDB获得ppt。

推荐了两个变异注释工具：

RegulomeDB, created by the Synder and Cherry Labs in 2012

http://www.regulomedb.org/

https://github.com/aboyle/RegulomeDB-Tools 

HaploReg，出自Kellis lab。还记得Kellis吗？MIT理工男Manolis Kellis讲基因、疾病与治疗 |  TEDx视频

http://www.broadinstitute.org/mammals/haploreg/haploreg.php 

本期视频只介绍了RegulomeDB的用法，下期回答问题2时详细介绍HaploReg的用法。

告诉它你感兴趣的位点，它就告诉你这个位点的变异有没有影响转录因子结合，有没有影响基因表达。

原  理

从因果两个层面找证据，分析您的变异位点是否会影响基因转录。

转录调控是原因：如果基因上游调控区发生变异就可能影响基因的转录激活。例如motif的变异导致TF无法结合，那么原本由该TF激活转录的靶基因无法正常转录，可能会导致肿瘤或遗传疾病发生。

基因表达水平是结果：从eQTL数据能看到SNP造成的结果，即基因的变异导致附近基因转录水平的变化。

为了最全面的从因果两方面注释您的变异位点，RegulomeDB收集了各个层面的调控数据，编译自http://www.regulomedb.org/help：

1. 转录因子的ChIP-seq，以ENCODE项目产生的为主、还包括一些非ENCODE项目产生的、以及ChIP-exo（最精准的ChIP-seq）数据；

2. 组蛋白修饰的ChIP-seq，只用了Roadmap的数据，Roadmap Epigenomics Mapping Consortium(REMC)；

3. 开放染色质，用了ENCODE的DNase-seq；

4. 用motif预测转录因子结合位点，包括TRANSFAC、Jaspar、UniPROBE和Jolma 2013年Cell paper里的PWMs；

5. 差异甲基化区域，用Synder 2014年Nat Biotechnology paper里的；

   1-5是因，6是果

6. eQTLs、dsQTL，包括如下组织：Cerebellum、Cortex、Fibroblasts、Frontal-Cortex、Liver、Lymphoblastoid、Monocytes、Pons、T-cells、Temporal-Cortex
   

怎样评价

根据上述证据设置score。TF结合是因，表达量变化是果。只有观察到SNP位点影响了基因转录水平的表达量变化，才给它更好的score，1开头。如果没有eQTL证据支持，就是以2开头。

举个例子

界面简单得不能再简单

识别多种输入格式：dbSNP ID、bed、VCF、GFF3或chr#:min_coord..max_coord。

例如，E2F1上下游区域，chr20:33,627,434-33,734,653，点击Submit。找到495个SNP，按照Score排序，rs1033799的score最高，点击1d

位点、结论和证据都反映在这张图上

后面是详细信息：

• K562细胞系的CEBPB、RCOR1、TAL1 ChIP-seq在这个位置有peak，说明CEBPB、RCOR1、TAL1结合在这个SNP附近；

• 出现了Zbtb12的motif，推测Zbtb12有可能结合；

• 有一个eQTL，在单核细胞Monocytes里影响了ITGB4BP的表达量；

• 在K562里看到DNase信号，说明这个位置是开放的，可能有调控蛋白结合；

• 组蛋白修饰说明在Blood & T cell、B cell等细胞里是转录活跃的，而在ESC和iPSC里活跃程度低。

总结，SNP位点rs1033799很可能影响转录因子的结合，并影响靶基因的表达水平。

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