StatQuest学习笔记26——RNA-seq中的技术重复问题
前言
这是StatQuest系列视频教程笔记的最后一篇，我在YouTube上看了一下，作者还有其他的几个视频，有兴趣的同学还可以看看。这篇笔记是视频教程的第62节，主要内容是讲RNA-Seq中的技术重复问题。
是否需要技术重复
前面有一篇笔记我们提到了技术重复与生物重复，在这篇笔记中《StatQuest学习笔记02——样本量与重复》。但在RNA-Seq中，我们是否需要做技术重复呢？
答案是否，如果你做了生物学重复，就不需要做技术重复。或许有同学知道这个答案，但是却不清楚为什么做了生物学重复后，就不需要做技术重复了呢，后面我们就会回答这个问题，如下所示：
RNA-Seq变异的两个来源
RNA-Seq的测序数据的变异（variation）主要来源两个方面，第一个是生物学变异（Biological Variation），第二个是技术变异（technical variation）。
生物学变异
生物学变异是指生物本身本身造成的变异，例如，即使是遗传背景完全一样的小鼠，例如像C57BL/6N这样遗传背景都非常清楚的小鼠，也不存在RNA转录本数目完全相同的两只小鼠（只能是接近，而不是完全相同）。
任何物种的两个生物个体都不可能完全一样，无论这种生物是人，小鼠，还是果蝇。
技术变异
每当我们做一个实验时，在实验过程中都会参杂一些零碎的非实验因素（例如今天你的心情，不同批次的培养基，移液枪的吹打次数，细胞培养的时间，细胞的传代次数等等），其中的一些是完全100%的随机因素。因此，当我们再次重复这个实验的时，即使实验条件与上一次的实验条件完全相同，也不可能得到与上次实验100%相同的结果（当然，总体的结果会相差不大，会很接近），如下所示：
生物学变异的案例
为了说明这生物学变异和技术变异的问题，我们先来看一个简单的案例。
在这个案例中，我们只研究生物学变异。例如，我们对几只小鼠做了RNA-Seq，没有做任何技术重复。在下面的二维坐标系中，X轴是小鼠的编号，Y轴是小鼠基因X的reads数，下图是第1只小鼠的数据，如下所示：
我们再看一下第2只小鼠的数据，如下所示：
由于我们没有做技术重复，因此从上图中，我们可以知道，第2只小鼠与第1只小鼠的基因X的reads数差异就是完全来源于生物学变异了，也就是这两只小鼠自身的变异，现在看第其它小鼠的数据，如下所示：
假设我们把地球上的所有小鼠都给测了，也就是说上图的X轴上有无数个小鼠的基因X的reads数，此时，我们求出这所有小鼠基因X的reads数的平均值，并用希腊字母μ表示，这个μ就是小鼠基因X的reads数真正的均值，就是下面的这个样子：
现在我们计算出每只小鼠基因X的reads数与真实均值μ的差值，先看第1只小鼠，它与均值μ的差值是5，如下所示：
现在再计算出剩下的所有小鼠的基因X的reads数与reads数平均值的差值，为了方便说明问题，这里我们只计算前5只小鼠的数据，如下所示：
此时，我们使用数学公式来表示这前5只小鼠的基因X的reads数，这个公式很简单，如下所示：
现在我们计算出这5只小鼠的基因X的reads数的均值，如下所示：
把上面的公式再整理一下，应时下面的这个样子，如下所示：
其中上图公式右侧红圏的部分是几个常数，也就是每只小鼠基因X的reads数与均值μ的差值的均值，并且这个红圏中的计算结果（5-1+4+2-5=1）会随着小鼠样本数目的增多而缩小，从而最终近于0，那么上面的均值最终会等于实际的均值μ了，如下所示：
考虑生物学变异与技术变异的情况
还以上述的案例来说明一下生物学变异和技术变异，为了清楚地说明这两个变异，在下图中，我们使用橘黄色的线段来表示生物学变异，如下所示：
我们使用绿色的箭头来表示技术变异，其中绿色箭头向下表示技术重复导致的reads数降低，绿色箭头向上表示reads数上升的情况，如下所示：
现在我们考虑生物学变异和技术变异的情况下，来计算一下前5只小鼠的基因X的reads数均值，如下所示：
现在整理一下上面的均值公式，我们可以发现，这个公式可以公为3部分，第1部分是均值μ，第2部分是生物学变异，第3部分是技术变异，如果我们增加样本的话，那么这两个变异就会接近于0，因为它们的分子中既有正值，又有负值，因此最终会相互抵消，因此，做了生物学重复（一共有5只小鼠）的这批小鼠的最终基因X的reads均值就是μ，如下所示：
只做技术重复的情况
我们现在考虑另外一种情况，即我们只做了技术重复。例如针对第1只小鼠，我们做了5次技术重复，它的基因X的reads数如下所示：
其中生物学变异使用橘黄色表示，橘黄色线段的大小都一样，这是因为对同一只小鼠做了5次技术重复，同一只小鼠的生物学变异是一样的，另外，在下图中我们再添加上技术变异，技术变异使用绿色表示，如下所示：
现在我们计算一下第1只小鼠的基因X的reads数均值，如下所示：
其中我们可以发现，在这个案例中，第1只小鼠的基因X的reads数的均值由3部分构成。
第1部分是实际均值μ，第2部分是生物学变异，它是一个固定的值，因为对于一只确定的小鼠来说，它的生物学变异是确定的，因此针对这只确定的小鼠来说，无论做多少次技术重复，它的生物学变异都是一个固定值，不会相互抵消，在这里，这个值是5。第3部分是技术变异，不过由于技术变异的分子部分有正数，有负数，因此随着技术重复的增多，技术变异的分子会相互抵消，最终接近于0，因此第1只小鼠基因X的reads数的均值最终结果是μ+5。
比较生物学重复和技术重复
生物学重复
现在我们比较一下生物学重复和技术重复，回到我们前面的部分，我们知道，基因X的reads数的平均值公式是由3三部分构成的，其中第1部分是真实的均值μ，第2部分是生物学重复，用橘黄色表示，第3部分是技术重复，用绿色表示，如下所示：
第1部分是真实的均值μ，这里再强调一下，真实的均值可以理解为所有小鼠基因X的reads数的均值，而我们平时所测的小鼠基因X的reads数是对这个均值μ的估计值，因为我们不可能把所有的小鼠基因X都给测了，估计值只能无限接近于真实均值μ，但法等于均值，不过当样本量足够大时，此时的估计值就可以视为均值μ。
公式的第2部分是生物学变异，第3部分是技术变异。由于生物学变异和技术变异的分子部分都是有正值，负值，因此第2部分与第3部分最终会抵消，得到的结果就会非常接近于真正的均值μ，它就代表了所有的小鼠基因X的reads数，如下所示：
无生物学重复
现在我们再看一下无生物学重复，有技术重复的情况下，我们计算一下第1只小鼠的基因X的reads数均值，如下所示：
这个公式由3部分组成，即真实均值μ，生物学变异和-技术变异，如果我们不断地增加样本，那么这个均值就成了Average = μ +5，最终这个结果只能提供第1只小鼠的信息，而非其它所有小鼠的信息，也就是说，此时的这个μ+5只是第1只小鼠基因X的reads数均值，而不是真实的均值μ，它不能代表整个小鼠的基因X的reads数，如下所示：
结论就是，如果我们只对这个小鼠做多次技术重复，最终得到的数据就是这个小鼠的数据，不具有代表性，也就是说，如果别人的实验室重复这个实验的话，有可能重复不出来。
同时做生物学重复和技术重复
此时我们可能会想，如果我既做了生物学重复，又做了技术重复，那么是不是能得到最精确的结果？
很不幸，答案是否定的。在下面的这个案例中，我们对第1只小鼠做了2个技术重复，第2只小鼠做了3个技术重复，如下所示：
那么我们求出均值，如下所示：
如果我们不再做另外的生物学重复，那么上述公式的第2部分（也就是橘黄色的生物学变异部分）就不会相互抵消，最终接近于0，如下所示：
但是，如果做了更多的生物学重复，那么它会接近于0，不过需要的生物学重复数量会更多，因为如果生物学重复的数量量不是特别多的话，这第2部分就不会很快地接近0，如下所示：
我们就看一下，将中间这一项相互抵消为0需要多少个生物学重复。我们对第2只小鼠做了3次技术重复，这3次技术重复中，每个技术重复的生物学变异是相同的，例如第2只小鼠的生物学变异是-1，那么第2只小鼠做了3次技术重复，这3次技术重复的变异分别为2，-2，-1（图中数据），由于是同一只小鼠，那么这3次技术变异对应的生物学变异是一样的，分别是-1，-1，-1（还是图中数据）。
因此，为了降低这种生物学变异的程度，至少也是降低到与前面测了5只小鼠（第1只小鼠到第5只小鼠）同等的水平，那么我们一共需要做15次，这15次就是：5个生物学重复，1个生物学重复做3次技术重复，一共是15次。用公式表示就是下图中的最后一行，如下所示：
现在我们比较一下这三种实验（分别是①只做生物学重复；②既做生物学重复，又做技术重复；③只做技术重复）的情况：
从上述的结果我们可以发现这些规律：
只做生物学生重复的结果最接近于均值μ，这是最好的结果；
既做了生物学重复，又做了技术重复的话，它要么接近于均值μ（这个需要做更多的生物学重复，生物学重复与技术重复加起来要做15次），要么是均值
μ+常数（只做更多的技术重复，不做更多的生物学重复）；最差的结果就是不做生物学重复，只做技术重复，如下所示：
结论就是，只做生物学重复就行了，就像上面的第1种情况，此时，我们只需要测序5次即可，如果既做生物学重复，又做技术重复，那么我们就需要测序15次，相当于成本直接上升到原来的3倍。